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高效液相色谱法测定人参渣中人参多糖的含量

首席医学网      2010年12月29日 17:24:21 Wednesday  
 
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作者:木海鸥 金玉琴 吴 煜    作者单位:温州医学院附属第二医院 温州 325027 浙江省温州市第三人民医院

【关键词】  人参 多糖 高效液相色谱法

 人参,别名为山参、园参,为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根,其叶也入药,称为参叶。我国是世界上人参生产大国,其产量占全世界的60%,种植地主要分布于我国东北各省,辽宁、吉林有大量栽培,近年河北、山西、陕西、甘肃、宁夏、湖北等省区也有种植[1]。作为我国特产的珍贵药材之一,人参具有调节中枢神经系统、改善心脏功能、降血糖作用、增强机体的免疫功能、抗肿瘤、抗氧化等作用,因而自古以来就被作为名贵的补品。

  人参以其特殊的医疗保健功能,得到充分的开发利用,如今人参加工产品种类越来越多,如人参保健品、人参药酒等,但是大量废弃的根渣中仍含有丰富的活性成分。人参多糖 (ginseng polysaccharide,GPS) 作为人参的主要活性成分之一,具有提高肌体免疫力、抗肿瘤、降血糖以及调控血细胞生成的作用[2]。国内测定多糖含量常用硫酸蒽酮和硫酸苯酚分光光度法,但误差较大,现有的比色重现性差,受影响因素多,尤其蒽酮试液加热后对最大吸收峰影响较大。高效液相色谱法是在经典的液相色谱基础上发展起来的一种高效、高速、高灵敏度的分析方法,目前其应用已超过气相色谱法[3]。本文采用高效液相色谱法对人参渣中的人参多糖进行定量分析,为综合开发利用人参的新途径提供科学参考依据。

  1 仪器与试剂

  Agilent technologies1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);光电二极管阵列检测器;N2000 色谱数据工作站;UV2500型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);TGL16G高速冷冻离心机(香港力康发展有限公司);KQ250B超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。D无水葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所,批号:1108332200302,供含量测定用);甲醇(HPLC级,美国Tedia公司);人参渣为保健品公司产品加工后的人参渣废弃物。

  2 方法与结果

  2.1 波长选择

  称取D无水葡萄糖对照品1.0mg,置于100ml容量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,用紫外分光光度计在200~400nm波长范围内扫描,分析紫外吸收图谱可见,葡萄糖在214nm处有最大吸收峰,因此选择此处为检测波长。

  2.2 色谱条件

  色谱柱Nova Pak C18 (150mm×3.9mmColumn,4μm,美国Waters公司);流动相为水甲醇(1∶1),用磷酸调节pH值至3.0;流速为1ml/min;柱温30℃;检测波长为214nm;进样量为20μl。在上述色谱条件下,D无水葡萄糖的保留时间为6.687min。

  2.3 对照品溶液的制备

  精密称取一定量的经80℃ 干燥至恒重的D无水葡萄糖对照品,加流动相制成浓度为10mg/ml的对照储备溶液。

  2.4 供试品溶液的制备

  将人参渣经60℃减压干燥24小时后,粉碎、过筛,得到100目的人参渣粉。加适量纯净水常温浸泡1小时,加热至45℃,超声波功率200W,超声提取30min,过滤后将滤液浓缩至原体积的1/3,向浓缩液中加乙醇使含醇量达85%,静置12小时,离心(3000r/min)15min,弃去上清液,取沉淀物于恒温干燥箱中干燥后即得多糖粗品。将所得多糖粗品溶于适量流动相,于100℃条件下水浴90min,得到供试品溶液。

  2.5 线性关系考察

  取对照储备液,依次稀释成浓度为0.5、1、2、4、6、8、10mg/ml的溶液进行HPLC测定,以峰面积为纵坐标、溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线,求得回归方程为Y=95736X+ 482411,r2= 0.9995(n=7),结果表明葡萄糖质量浓度在0.5~10mg/ml范围内与峰面积线性关系良好。

  2.6 精密度试验

  取对照储备溶液,将其稀释成浓度为0.2mg/ml的溶液,精密吸取20μl,连续进样6次,测得葡萄糖峰面积的相对标准偏差(RSD值)为0.58%(n=6),表明该法具有良好的精密度。

  2.7 稳定性试验

  取供试品溶液,按进样色谱条件分别于0、4、8、12、24小时测定葡萄糖峰面积,得到RSD值为0.96%,表明供试品溶液在24小时内稳定。

  2.8 重复性试验

  精密称取人参渣粉6份,每份约5g,按2.3项方法制备,置于100ml容量瓶中,加流动相至刻度,进样20μl,用HPLC法测定每份样品中人参多糖的含量。结果测得1mg人参渣中人参多糖(以D无水葡萄糖计)的平均含量为0.3802mg。RSD=1.68 %,表明试验重复性好。

  2.9 加样回收率试验

  精密称取人参渣粉6份,每份约50g,按2.3项方法制备,置于100ml容量瓶中,加流动相至刻度,进样20μl,用HPLC法测定。计算平均加样回收率为100.43%,其RSD值为1.06%,见表1。表1 样品加样回收率试验结果

  3 讨 论

  制备供试品溶液的过程中,分别进行不同水解时间的考察,发现随着时间延长,水解效果越好,但当水解达到90min后,峰面积无明显变化,故选择90min为本实验的水解时间。

  目前常用的多糖类化合物的提取技术主要有[4]:①热水浸提法;②水提醇沉法;③碱提取法;④酸提取法;⑤超声提取法;⑥酶提取法。其中,超声提取技术适用于天然产物,特别是中草药有效成分如多糖、黄酮等各种类型成分的提取,是中药制药彻底改变传统提取工艺的新方法、新工艺[5]。与常规的提取方法相比,该法具有提取温度低、适用性广、能耗低等特点。另外,超声波破碎过程是一个物理过程,提取过程中无化学反应,被提取的生物活性物质在短时间内保持不变,生物活性不减,同时,提高了细胞破碎速度,缩短了破碎时间,可极大地提高提取效率[6]。本研究比较了水提醇沉法和超声提取法的多糖提取效率,发现超声提取不仅多糖含量要高出12%,且节省大部分时间。

  本研究建立了HPLC法测定人参渣中活性成分—人参多糖的含量,该法准确可靠、易操作、灵敏度高,测得人参渣中含有38%的人参多糖,说明人参渣仍具有进一步开发利用的价值。

【参考文献】
   \[1\] 宋小妹,唐志书.中药化学成分提取分离与制备\[M\].北京:人民卫生出版社,2009.72.

  \[2\] 赵俊,吴宏,王亚平.人参多糖的化学与药理学研究进展\[J\].国外医学,中医中药册,2004,26(2):7981.

  \[3\] 高文远.现代中药质量控制及技术\[M\].北京:科学出版社,2010.63.

  \[4\] 张昌军,原方圆,邵红兵.超声波法在提取多糖类化合物中的应用研究\[J\].化工时刊,2007,21(2):5456.

  \[5\] 宋小妹,唐志书.中药化学成分提取分离与制备\[M\].北京:人民卫生出版社,2009.8.

  \[6\] 邓修.中药制药工程与技术\[M\].上海:华东理工大学出版社,2008.127128.

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