您所在位置: 首页 > 期刊 > 过刊浏览 > 中国医学> 《中国中医药信息杂志》> 2009年9月16卷9期>实验研究> 文章详情

甘草甜素对HepG2.2.15细胞株HBV感染的影响

首席医学网      2010年01月20日 10:58:54 Wednesday  
 
  加入收藏夹   官方投稿信息

作者:李永伟,郭云蔚,李刚,凌小强,李桂侠    作者单位:中山大学附属第三医院,广东 广州 510630) 教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-04-0797

【摘要】  目的 探讨甘草甜素(GL)对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的作用,及对细胞存活率的影响。方法 实时荧光定量PCR检测HBV DNA的表达,ELASA检测HBV所分泌抗原,MTT检测细胞的增殖活性,计算细胞存活率。结果 给药后各组HBsAg分泌结果显示总体均数间差异显著(P=0.000),GL各组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),抑制作用存在剂量依赖关系;而对HBeAg水平的影响因剂量不同而表现为升高和降低两种趋势,除50 μg/mL组外,其余各组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),但800 μg/mL组HBeAg分泌增加,400 μg/mL以下组为HBeAg降低;HBV DNA的表达显示GL各组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),但400 μg/mL以下组为HBV DNA降低,800 μg/mL组出现HBV DNA复制增强;MTT实验显示,200 μg/mL以下3个剂量组均可促进细胞增殖(P<0.01),400、800 μg/mL 2组均显著抑制细胞增殖(P<0.01);MTT分别与HBeAg和HBV DNA水平呈显著负相关(P<0.01),但与HBsAg呈显著正相关(r=0.869,P=0.000)。结论 GL对HepG2.2.15细胞株上清中的HBeAg和HBV DNA水平可能具有双向作用,而对HBsAg具有剂量依赖的抑制作用,提示GL的使用应注意选择适应证及合适的剂量。

【关键词】  甘草甜素;乙型肝炎病毒;HepG2.2.15细胞株

Effect of Glycyrrhizin on Heptitis B Virus Infection in HepG2.2.15 Cell Line 

  LI Yong-wei, GUO Yun-wei, LI Gang, et al

  The Third Affiliated Hospital of SUN Yat-sen University, Guangzhou 510630, China

    Abstract:Objective To investigate the effect of glycyrrhizin (GL) on the expression of hepatitis B virus e antigen (HBeAg), hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), HBV DNA levels and cell proliferation in HepG2.2.15 cell line. Methods HBV DNA level was examined by Real-time PCR. HBsAg and HBeAg levels were examined by ELASA, and cell proliferation was examined by MTT before and after stimulated with GL. The GL groups were compared with the blank control group. Results HBsAg levels in the GL groups were inhibited in dose-dependent manner compared with the blank control group (P<0.01). HBeAg levels in GL 400, 200, 100 μg/mL groups were inhibited significantly compared with the blank control group (P<0.05). HBV DNA levels in GL groups with the dose below 400 μg/mL were inhibited significantly compared with the blank control group. HBeAg and HBV DNA levels in the 800 μg/mL group were increased significantly compared with the blank control group (P<0.05). GL in the three groups of 200, 100, 50 μg/mL could s
ignificantly promote cell proliferation, respectively (P<0.05). The 400 μg/mL and 800 μg/mL groups inhibited the growth of cells significantly (P<0.01). Cell proliferation were notably negative correlated with the expression of HBeAg and HBV DNA levels (P<0.05), but positive correlated with HBsAg levels (r=0.869, P=0.000). Conclusions GL could inhibit or promote cell proliferation, HBeAg level and HBV DNA level in HepG2.2.15 cell line, while inhibit HBsAg secretion in dose-dependent manner. To choose appropriate disease and dose with GL treatment is important.

    Key words:glycyrrhizin;hepatitis B virus;HepG2.2.15 cell line
 
    甘草的化学成分极为复杂,迄今为止,从甘草中分离出甘草甜素(GL)、甘草次酸、甘草苷等数十种化合物。GL和黄酮类物质是甘草中最重要的生理活性物质,主要存在于甘草根表皮以内的部分。GL是一种五环三萜皂苷,其中甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)是GL的皂苷配基,也是GL的有效活性成分之一[1]。GL具有抗炎、抗纤维化、降酶、退黄、抗病毒及免疫调节等作用,临床上被广泛用于治疗各种急慢性肝炎。体外实验表明,GL降低乙型肝炎病毒(HBV)感染细胞HBsAg的表达[2-3],并可能因为具有诱生干扰素的作用,被认为可抑制HBV[2,4-5]。本实验观察了多种浓度梯度的GL体外对HepG2.2.15细胞株的两种抗原和HBV DNA水平的影响,以了解GL抗HBV的规律。

  1  材料与方法

  1.1  试剂、仪器及药物

    DMEM 培养基(GIBCO公司),G418和MTT(Sigma公司),胎牛血清(GBico公司),96孔、6孔培养板及25 cm2培养瓶(COSTER公司),酶标仪(BIO-RAD、Model450 MICRoPLATE READER),ELISA试剂盒购自中山生物公司,Real-time PCR检测试剂盒购自中山大学达安基因公司,GL(商品名:美能)由日本美能生源制药公司生产。HepG2.2.15细胞株由本实验室保存。其他试剂来自于广东省肝脏疾病研究重点实验室。

  1.2  分组及药物浓度设定

    将GL按原药物浓度用DMEM培养液倍比稀释成5个浓度梯度:800、400、200、100、50 μg/mL;并设空白对照组。

  1.3  细胞培养

    将HepG2.2.15细胞铺于6孔板,接种于DMEM 混合培养液(含1O%胎牛血清、200 μg/mL G418以及谷氨酰胺、青霉素、链霉素等),每孔培养液共2 mL,置5%CO2培养箱中37 ℃培养,第2、5日加入相应剂量GL,同时更换培养液。第7日收集细胞上清检测,每剂量组3个复孔,共3次独立实验完成。

  1.4  细胞存活率测定

    药物细胞增殖实验通过MTT法测定细胞存活率,细胞接种于96孔板,接种第2、5日给药,第7日每孔加入1 mg/mL MTT液,每孔20 μL,于5%CO2培养箱中37 ℃培养4 h,吸弃上清液,每孔加入DMSO 200 μL,约10 min后酶标仪检测。细胞存活率(%)=实验孔OD值/对照孔OD值×100%。

  1.5  HBsAg、HBeAg检测

    取收集的上清液,用ELISA法检测,按试剂盒说明书操作。含量直接用OD值表示。

  1.6  荧光定量PCR检测HBV DNA的表达

    培养至第7日,收集细胞上清液提HBV DNA(Qiagen Blood Mini Kit,Gene copmpany),达安基因公司HBV DNA荧光定量PCR试剂盒检测HBV DNA的表达水平,按说明书操作。

  1.7  统计学方法

    实验结果用x±s表示,采用SPSS11.0统计软件对数据进行单因素方差分析,并行Pearson相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。

  2  结果

  2.1  甘草甜素对HepG2.2.15细胞增殖活性的影响

    结果显示,细胞增殖活性总体均数间差异有统计学意义(P=0.000),各组间差异显著(P=0.000),随GL量的增加,由促进增殖而变为抑制增殖,即较小剂量促进细胞生长,400 μg/mL以上剂量组则开始变为抑制细胞增殖,尤其是800 μg/mL组更为明显,存活率只有23.1%,本结果与文献报道[2]类似,见表1。

  2.2  不同剂量甘草甜素干预后细胞培养上清HBsAg、HBeAg、HBVDNA的表达

    GL各剂量组给药后第7日HBsAg表达总体均数间差异有统计学意义(P=0.000)。GL各剂量组分别与空白对照组比较,及各组间比较差异显著(P<0.01),其抑制水平具有剂量依赖关系,剂量越大抑制越明显。而GL对HBeAg水平因剂量不同而表现为升高和降低两种趋势,其中50 μg/mL与空白对照组之间比较P=0.811>0.05,两者间差异无统计学意义;其余各组与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),但800 μg/mL组HBeAg分泌增加,400 μg/mL以下组为HBeAg降低。HBV DNA的表达在GL各组分别与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),但800 μg/mL组为病毒复制增强,其余组为抑制HBV DNA,见表1。表1  GL对HepG2.2.15细胞增殖率及细胞上清HBeAg、HBsAg、HBV DNA水平的影响(略)

  2.3  甘草甜素干预后各指标的相关性

    GL干预后,MTT结果与HBeAg呈显著负相关(r=-0.714,P=0.000),与HBsAg呈显著正相关(r=0.869,P=0.000),与HBV DNA水平呈显著负相关(r=-0.764,P=0.000)。

  3  讨论

    GL被认为具有抗HBV的作用,但从临床中所得结论多为小样本非随机双盲的临床观察,具有一定的HBeAg、HBsAg阴转率[6-7]或HBV DNA阴转率[7],前者报道显示疗效以l60~200 mg剂量组较好,提示其效果与剂量有关。体外实验显示,该药可降低表面抗原水平,对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率呈药物浓度和时间依赖性,随剂量增加而抑制增强[2]。在不同的细胞系Alexander细胞也显示可抑制表面抗原[3],其机制是通过抑制HBsAg与唾液酸结合,阻断其在细胞内的转运过程,从而抑制HBsAg向细胞外分泌,但使细胞内HBsAg蓄积。这种机理不通过抑制HBV复制所产生,虽然可能减少由表面抗原所致的免疫反应带来的病理损伤,但细胞内HBsAg蓄积可使其与宿主的细胞蛋白相互作用,可能会引起其他的病理改变。

    本研究及文献报道均显示,在一定药物浓度下(≤200 μg/mL), GL有使HepG2.2.15细胞增殖的作用,其存活率>100%,而800、400 μg/mL 2组则抑制细胞增长。200 μg/mL以下组促进细胞生长的作用随GL剂量增加而减少,最高为50 μg/mL组,达到122.5%。该结果与我们既往研究中GL对细胞存活率的影响有所差别[8],后者为200 μg/mL以下组细胞存活率随剂量增加而增加,200 μg/mL组存活率最高;对HBeAg和HBV DNA的影响水平亦有不同。既往研究显示400 μg/mL组明显抑制HBeAg, 50 μg/mL组抑制HBV DNA复制[8],较为一致的结果是2组实验中的最高剂量组对HBeAg分泌和HBV DNA表达水平的影响一致,即均为增强。上述两个研究之间的差别可能与两种细胞所感染的HBV不同及给药时间有关。既往研究所用HepG2.2.15细胞株表面抗原无明显表达,ELASA检测为阴性范围,而且在G418的维持下,既往所用细胞株活力不如本次实验的HepG2.2.15野生株,考虑前者可能存在HBV基因的变异。两次实验结果提示,GL对不同HBV感染细胞株的影响可能具有差异;另外,既往实验给药时间为细胞接种后的第5、6日[8],而本次实验为接种后的第2日及第5日,药物持续作用于细胞,因此也可能导致结果有差异。

    有人认为GL抗病毒的机理可能与诱生干扰素有关。李氏等[9]研究了GL对单个核细胞的影响,其产生干扰素的最适剂量为100 μg/mL。干扰素产生的重要途径为TLR家族信号途径,体外实验已证实给予TLR的配体可抑制小鼠HBV[10]。我们既往采用流式细胞技术检测GL作用后的细胞,结果表明GL可上调先天免疫中的病原识别受体TLR2、TLR4,在HBsAg阴性的HepG2.2.15细胞株以100 μg/mL组表达TLR2、TLR4的阳性细胞数最多[8],结合李氏等[9]研究结果,考虑这可能与干扰素的产生有一定关系。但HBeAg、HBV DNA被明显抑制的剂量分别是400、50 μg/mL,并未能体现出与TLR表达阳性细胞数相一致的抑制强度,可能与TLR在细胞上的表达强度有关系;另有文献已证实,不同的HBV病毒株导致TLR的表达也不一样[11],既往实验所用细胞株所感染的HBV已发生变异,导致HBV复制规律发生了变化,可能会影响到TLR的表达。上述原因均可能导致TLR表达阳性细胞数与病毒抑制不一致的结果,并可能导致两次实验结果之间的差异。总之,GL抗HBV的效应及机理尚需进一步验证。此外,我们推测如GL能在体内激活TLR信号途径,不仅可诱生干扰素,也可进一步诱导HBV特异性的细胞免疫,从而促进HBV清除。该假设值得进一步研究。
   
  本研究结果初步表明,GL既可能抑制也可能促进HBeAg分泌和HBV DNA复制,此两者与细胞存活率呈负相关,与其对HBV变异的细胞株一样具有类似双向作用,并与剂量有关。根据上述研究及文献报道,需要进一步明确GL的作用机理,选择合适的治疗对象和剂量。甘草中还含有较为丰富的甘草多糖,它也是甘草中的一种抗病毒成分,但其对HBV的作用尚未见报道,值得研究。

【参考文献】
    [1] 陈 红.甘草药理作用概述[J].海峡医学,2005,17(4):37-40.

  [2] 杨 京,喻成波,席宏丽,等.甘草甜素联合单磷酸阿糖腺苷对HepG2.2.15细胞及其HBsAg表达的影响[J].贵州医药,2006,30(6):483-485.

  [3] Fujisawa K, Watanabe Y, Kimura K, et a1. Therapeutic approach to chronic active hepatitis with glycyrrhizin[J]. Asian Med J, 1980,230:745.

  [4] 蒋道荣.甘草甜素对慢性乙型肝炎患者血清病毒标志的影响[J].南通医学院学报,1994,14(2):231-232.

  [5] 宋星宏.甘草甜素治疗慢性乙型肝炎疗效观察[J].中国中西医结合杂志,1997,17(8):494-495.

  [6] 朱友才.甘草甜素对血清乙肝标志的影响[J].新药与临床,1989,6(4):237-238.

  [7] 罗永芳,丁静娟,周 莉,等.甘草甜素聚肌胞并用对血清HBV标志的影响:附46例报告[J].贵州医药,1992,16(2):75-76.

  [8] 李永伟,杨宏志,柯千山,等.甘草甜素对HBsAg低表达HepG2.2.15细胞株HBV感染及TLR2、4的影响[J].中药材,2008,31(3):403-407.

  [9] 李金兴,郭履峒.甘草甜素对新生儿脐血单个核细胞产生γ-干扰素的影响[J].上海医科大学学报,1991,18(2):104-108.

  [10] Masanori I, Michael DR, Yoshihiro F, et al. Toll-like receptor signaling inhibits hepatitis B virus replication in vivo[J]. Journal of Virology,2005,6:7269-7272.

  [11] Riordan SM, Skinner N, Kurtovic J, et al. Reduced expression of toll-like receptor 2 on peripheral monocytes in patients with chronic hepatitis B[J]. Clinical Vaccine Immunology,2006,13(8):972-974.

  订阅登记:

请您在下面输入常用的Email地址、职业以便我们定期通过邮箱发送给您最新的相关医学信息,感谢您浏览首席医学网!

邮箱:    专业:    职称:      

医学期刊医学会议医学专区医学护理