局部应用维生素C对脂肪细胞凋亡的影响
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首席医学网
2009年07月10日 09:52:13 Friday
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作者：高雁，韦强，陈石海，殷国前，刘庆丰，廖明德 作者单位：530021 广西南宁，广西医科大学第一附属医院整形美容外科（△通讯作者）
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【摘要】 目的 观察局部应用维生素C对脂肪细胞凋亡的影响。方法 将72只大鼠按局部注射维生素C浓度的不同(006%、012%、024%)随机分为A、B、C 三个实验组，每个实验组按时间的不同(7d、21d、35d)又细分3个亚组,每个亚组8只大鼠。同时在大鼠两侧腹股沟脂肪垫随机选择一侧作为实验侧，另一侧为对照侧。在注射7d、21d、35d后切取组织标本，采用TUNEL免疫组化法显示组织切片中的脂肪细胞凋亡数目。结果 B和C组实验侧的脂肪细胞的凋亡数目均较对照侧增加（P<005），A组试验侧的脂肪细胞的凋亡数与对照侧比较差异无显著性（P>005）。B和C组试验侧的脂肪细胞的凋亡数目均随着作用时间的延长有增加趋势（P<005）；且C组试验侧较B组实验侧相应作用时间点增加（P<005）。结论 在大鼠局部脂肪组织注射含012%和024%维生素C的试剂有诱发脂肪细胞的凋亡作用。并且上述作用有明显的浓度依赖性和时间依赖性。而局部注射含006%维生素C的试剂对脂肪细胞的凋亡无明显影响。
【关键词】 维生素C；局部注射；脂肪细胞；凋亡
The effect of local injection with Vitamin C to adipocytes apoptosis
GAO Yan, WEI Qiang, CHEN Shi-hai, et alThe First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021，China
【Abstract】 Objective To observe the effect of injection with Vitamin C to adipocytes apoptosis Methods 72 Sprague-Dawley rats were randomly divided into A, B and C groups (006%, 012% and 024%) by concentration of Vitamin C Each group was randomly divided into three subgroups by inject time 7d, 21d and 35d with eight rats in each subgroup Two sides inguinal fat pad of Sprague-Dawley rats were randomly divided into the experimental and control side On the 7th, 21st and 35th days, specimens were taken from each rat Adipocyte apoptosis was measured by TUNEL method Results In B and C groups, the amount of adipocyte apoptosis was more in the experimental side than that in the control side (P<005), but there was no significant difference in the amount of adipocyte apoptosis between the experimental side and control side in A group (P>005) In B and C groups, with the injection continuing, the amount of adipocyte apoptosis increased gradually in the control side (P<005), and that of C group was more than that of B group (P<005) Conclusions Local injection with experimental solution containing 012% and 024% vitamin C in adipose tissue can promote adipocyte apoptosis Meanwhile, the effect is obvious correlative with concentration and time But injection with the experimental solution containing 006% vitamin C doesn't have significant impact on adipocyte apoptosis
【Key words】 Vitamin C; local injection; adipocyte; apoptosis
软组织形态异常的修复一直是整形外科研究的重点之一。软组织中脂肪组织占大部分。其形态大小是动态变化的，主要取决于所含有的脂肪细胞的数目和成熟脂肪细胞的体积改变，此变化过程受各种体内外因素的影响。过去人们把研究主要放在脂肪细胞的增殖和分化上，而对脂肪细胞凋亡的研究不多，自从1994年Prins等［1］发现脂肪细胞凋亡现象后，通过研究促进脂肪细胞凋亡的因素，减少脂肪细胞的数目，进而达到减少脂肪组织的目的成为一个新的研究方向。
有研究发现维生素C在体外实验中可促进脂肪细胞凋亡的现象。本文通过在大鼠腹股沟脂肪垫注射含不同浓度的维生素C，观察不同浓度维生素C对脂肪组织中的脂肪细胞凋亡的影响，探讨维生素C对脂肪细胞数目调节作用及其机理，以期为软组织的修复与重建提供新的治疗手段或有益的启示。
1 材料与方法
11 实验动物 健康成年SD大鼠72只，12月龄左右，体重（300±30）g，雄性，纯系，由广西医科大学动物试验中心提供。
12 试剂和仪器 凋亡试剂盒购于北京中山生物技术有限公司、Leica Q500MC显微图像分析仪(DMR+Q550,德国)。
13 实验方法
131 动物分组 72只SD大鼠将随机分成含006%维生素C实验组（A组）、含012%维生素C实验组（B组）、含024%维生素C实验组（C组），其中各组又根据注射后不同时间（7d、21d、35d）分为3个亚组，每亚组8只。每只大鼠随机选择一侧腹股沟为试验侧，另一侧为对照侧。饲养室温度 18℃～22℃，相对湿度60%～75%，人工混合饲料喂养。
132 注射药物 常规皮肤碘尔康消毒，随机选择在一侧腹股沟为试验侧，另一侧为对照侧。于腹股沟对称试验区域(以腹股沟为中线，长35cm，宽15cm区域内) 局部均匀注射4ml的试验试剂。
1321 实验侧 在实验区域注射含一定浓度的维生素C的试剂。
1322 对照侧 在对应区域注射不含维生素C的等体积试剂。
133 取材 在注射药物后7d、21d、35d时，用2%的戊巴比妥钠（02ml/100g）腹腔注射麻醉，术区备皮，碘尔康消毒术区，在SD大鼠一侧以腹股沟为轴线中间取1cm×1cm大小的标本，标本的切取深度包括皮肤全层及皮下脂肪深达肌膜层。
134 免疫组化染色 标本经10%福尔马林溶液固定、包埋、切片后利用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick and labeling,TUNEL）法检测脂肪细胞的凋亡情况。同时设立阳性对照及阴性对照。
135 脂肪细胞凋亡数测定 凋亡脂肪细胞判断和计量：TUNEL阳性细胞为单个散在分布，细胞呈典型的凋亡形态，周围无炎症反应，阳性染色呈红色。其中设立经过DNA酶处理的切片为阳性对照片，PBS代替TUNEL反应混合物为阴性对照片。将切片置于400倍显微镜下观察其病理表现，应用病理图像分析仪计数凋亡脂肪细胞数量，每张切片随机取8个视野，每个视野面积3354392μm2 ，取其计数结果的平均值作为该切片的脂肪细胞凋亡数。
136 统计学分析 试验所得数据以x±s表示，用配对t检验比较组内差异，用方差分析比较组间差异。P<005作为差异具有统计学意义。
2 结果
21 动物的一般状况 所有大鼠在实验过程中均无脱失、死亡。于麻醉后约2～4h苏醒，开始活动，自由进食、进水。喂养期间动物的活动好，食欲可，体重较稳定。
22 脂肪细胞的凋亡数目计数 如表1和图1～5所示，B、C组实验侧的脂肪细胞的凋亡数目分别均较对照侧增加（P<005）；A组实验侧的脂肪细胞的凋亡数与对照侧比较差异无显著性（P>005）；B、C组实验侧脂肪细胞的凋亡数目均随着作用时间的延长有增加趋势（P<005）；且同一作用时间点C组脂肪细胞的凋亡数较B组增加（P<005）。表1 注射药物后各组脂肪细胞的凋亡数的组内比较★P<005相同浓度下不同时间与前一时间点比较▲P<005相同时间下不同浓度与前一浓度比较
3 讨论
细胞凋亡（Apoptosis）是一种不同于细胞坏死的细胞生理性死亡方式。细胞凋亡和增殖分化一样，是一个受多基因调控的过程，从凋亡的启动到凋亡细胞被吞噬均是基因调节的结果，同时这些基因活动也会受到外界和内部各种因素的影响。有研究显示维生素C具有促进细胞凋亡和抗细胞凋亡的双重作用，其促进凋亡和抗凋亡的作用在很大程度上是依赖于其量的多少和所作用的细胞类型，其作用机制尚未定论［2，3］。Bagchi［4］ 等研究认为维生素C作为抗氧化剂，其保护细胞DNA免受损伤的作用是通过调节基因Bcl-2、p53的表达而实现的。Reddy 和Qi ［5，6］等研究认为维生素C可以通过不同途径促进肿瘤细胞死亡：维生素C下调转录因子AP-1，稳定p53，上调Bax基因，引起p53及其靶基因Bax积聚从而使宫颈癌细胞系Hela细胞的细胞周期阻滞，引起细胞凋亡。进入血浆中的抗坏血酸被氧化成脱氢抗坏血酸盐，进入细胞内，通过胞内的氧化还原系统还原，同时引起氧化还原应激反应，使细胞内谷胱苷肽（GSH）下降，脂质过氧化增多，从而使细胞出现凋亡。在哺乳动物细胞内，NO 作为一种细胞内生物信使或细胞毒性效应分子介导细胞凋亡,依其浓度和细胞内氧化还原状态启动细胞凋亡或细胞生存信号。维生素C可以通过维生素C-NO合酶及NO-细胞DNA途径调节细胞凋亡。我们的实验结果显示注射含中、高浓度的维生素C的试剂有促进脂肪细胞凋亡的作用，低浓度的维生素C的试剂对脂肪细胞凋亡的作用不明显，维生素C促进脂肪细胞凋亡的作用是呈浓度依赖性。林亚秋等［7］用维生素C对大鼠脂肪细胞凋亡的影响提示高浓度维生素C (100μmol/L)单独作用和与肿瘤坏死因子同时作用都可以显著提高脂肪细胞的凋亡率,而低中浓度维生素C (25～50μmol/L)作用不明显。本实验结果与林亚秋等在细胞水平实验结果部分相符合。同时实验发现脂肪组织切片中不仅仅是脂肪细胞，血管内皮细胞、腺体细胞和纤维细胞等同时发生也有不同程度的凋亡现象。这说明维生素C促进多种组织细胞的凋亡,但是对于各种组织细胞凋亡作用的强度是否一致，尚需要进一步的研究。本实验结果提示012%和024%浓度的维生素C可诱导脂肪细胞发生凋亡，可以减少脂肪细胞数目，并且作用与维生素C的浓度和作用时间成正相关。从而为局部脂肪组织沉积提供新的治疗手段或有益的启示。
【参考文献】
1 Prins JB, Walker NI, Winterford CM,et alApoptosis of human adipocytes in vitro Biochem Biophys Res Commun,1994,201：500-507
2 Harreus U,Baumeister P,Zieger SThe influence of high doses of vitamin C and zinc on oxidative DNA damageAnticancer research,2005,25：3197-3201
3 Verrax J,Bollen S,Delvaux MNew Insights about the Potential Application of the Association of Vitamins C (Sodium Ascorbate) and K3 (Menadione) as Auxiliary Therapy in Cancer Treatment Medicinal Chemistry Reviews,2005,4：277-282
4 Bagchi M,Kuszynski CA,Balmoori J,et alProtective efects of antioxidants against smokeless tobacco-induced oxidative stress andmodulation of Bcl-2 and p53 genes in human oral keratinocytesFree Radic Res,200l,35：181-194
5 Reddy VG,Khanna N,Singh NVitamin C augments chemotherapeutic response of cervical carcinoma HeLa cells by stabilizing p53Biochem Biophys Res Commun,200l,282：409-415
6 Qi CE,Michael GKPharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancer cells:Action as a pro-drug to deliver hydrogen peroxide to tissues Murali CProceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102：13604-13609
7 林亚秋,卢建雄,陈国柱，等维生素C对TNF-α诱导的原代培养大鼠脂肪细胞凋亡的影响细胞生物学杂志,2005, 27：469-473
(编辑：欣 阳)
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