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HPLC法测定吉祥草中β-胡萝卜素

首席医学网      2010年08月26日 11:55:33 Thursday  
 
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作者:陈 玲 鲍家科 徐 洪 熊慧林 陈万里    作者单位:(贵州省药品检验所 贵州 贵阳 550004)

【摘要】  目的:建立吉祥草中β-胡萝卜素的高效液相色谱测定方法。方法:以丙酮-石油醚(1∶1v/v)的混合溶液浸提吉祥草中β-胡萝卜素。色谱条件:色谱柱为DiamonsilC18柱(200mm×4.6mm,5μm),流动相:乙腈-甲醇-乙酸乙酯-三乙胺(80∶10∶10∶0.05);流速:1.0ml·min-1;柱温20℃;检测波长为450nm。进行了线性关系、精密度、稳定性、重复性、回收率等项的考察。结果:β-胡萝卜素的质量浓度在0.0074~0.0666μg范围内线性关系良好(r=0.9999),平均回收率(n=6)为99.33%,稳定性400分钟内RSD=1.94%。结论:该法专属性强,结果准确,重现性好,可用作吉祥草中β-胡萝卜素的含量测定方法。

【关键词】  吉祥草;β-胡萝卜素;高效液相色谱法

 HPLC Determination of β-carotene in Reineckia carnea(Andr.)Kunth

  Chen Ling Bao Jiake Xu Hong Xiong Huilin Chen Wanli

  【Abstract】Objective:A HPLC method was established for the determination ofβ-carotene in Reineckia carnea(Andr.)Kunth. Method:DiamonsilC18 column(200mm×4.6mm,5μm)with a mobile phase composed of Acetonitrile-Methanol-Ethyl Acetate-Triethylamine(80∶10∶10∶0.05)was used. The detection wavelength was 450 nm and the flow rate was 1.0 ml·min-1.Results:The calibration curves were linear between 0.0074-0.0666μg(r=0.9999)Average recoveries was 99.33%(n=6),RSD=1.94%.Conclusion:The method is rapid 、accurate and is suitable for the determination ofβ-carotene in Reineckia carnea(Andr.)Kunth.

  【Key words】Reineckia carnea(Andr.)Kunth;β-carotene;HPLC 吉祥草为百合科植物吉祥草Reineckia carnea(Andr.)Kunth.的干燥全草。具有滋阴润肺,凉血止血的功效。主要用于肺燥咳喘,阴虚咳嗽[1]。据报道吉祥草中含有较多的β-胡萝卜素[2],β-胡萝卜素是胡萝卜素的主要组成部分,而大量研究表明胡萝卜素是维生素A的重要来源,具有抗氧化、抗癌、抗辐射、增强免疫力等生理和药用价值[3-4]。目前有关吉祥草中β-胡萝卜素定量研究还未见报道。本研究采用高效液相色谱法,测定吉祥草中β-胡萝卜素,为全面控制吉祥草药材质量提供依据。

  1 仪器与试药

  紫外可见分光光度仪:岛津UV-2550型分光光度仪;高效液相色谱仪:岛津LC-2010ATH液相色谱仪,LC-solution色谱工作站。色谱柱为Diamonsil C18(200mm×4.60mm,5μm);β-胡萝卜素对照品(100445-200701,含量30.9%)购自中国药品生物制品检定所;吉祥草药材产自贵州省各地,经贵州省药品检验所熊慧林主任药师鉴定为百合科植物吉祥草Reineckia carne(Andr.)Kunth;甲醇、乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。

  2 方法与结果

  2.1 含量测定[4-8]

  2.1.1 检测波长的选择经对β-胡萝卜素对照品溶液进行紫外扫描,发现在450nm处有最大吸收峰。因此选择450nm作为检测波长。

  2.1.2 对照品溶液的制备:精密称取β-胡萝卜素对照品适量,加丙酮制成每毫升约含4.0μg的溶液。

  2.1.3 供试品溶液的制备:取吉祥草粉末1.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,用丙酮-石油醚(30~60℃)(1∶1v/v)的混合溶液重复浸提至溶液无色,浸提液置抽风橱内自然挥干,残渣用丙酮定溶至10ml,经0.45μm的微孔滤膜滤过,续滤液作为供试品溶液。

  2.1.4 色谱条件及含量测定:色谱柱为迪马C18(200mm×4.60mm,5μm),柱温20℃ ;流动相:乙腈-甲醇-乙酸乙酯-三乙胺(80∶10∶10∶0.05);流速:1.0ml·min-1;检测波长为450nm。

  测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,进行含量测定。

  2.1.5 线性关系考察:精密吸取上述β-胡萝卜素对照品溶液2,6,10,14,18μl注入高效液相色谱仪,依法测定,以峰面积为纵坐标,β-胡萝卜素浓度为横坐标,绘制标准曲线,线性回归方程:Y=12559750.00000x-3712.95000,R2=0.99995。结果表明,β-胡萝卜素在0.0074~0.0666μg范围内具有良好的线性关系,见图1。

  图1

  2.1.6 精密度考察:取同一对照品,分别重复进样6次,对照品溶液中β-胡萝卜素RSD=1.55%(n=6)。

  2.1.7 重复性实验:取吉祥草6份,精密称定,按“样品含量测定”项下的方法操作,制成供试品溶液,测定β-胡萝卜素的平均含量为37.96mg/g,RSD为1.68%。(样品为紫云县产)。

  2.1.8 稳定性实验:将配制好的供试品溶液在室温下放置,分别于0,80,160,240,320,400分钟测定,结果样品溶液在400分钟内基本稳定,RSD=1.94%。(样品为紫云县产)。

  2.1.9 加样回收率实验:精密称取已知含量的吉祥草共6份,分别加入等量β-胡萝卜素对照品,照供试品溶液的制备方法制备,测定含量,β-胡萝卜素平均回收率为99.33%, RSD=1.23%,(n=6) 。(样品为紫云县产)。

  2.1.10 吉祥草中β-胡萝卜素的含量测定:按“2.1.3”项下方法,制备供试品溶液,测定吉祥草中β-胡萝卜素的含量,测定结果见表2。表1 β-胡萝卜素回收率实验结果表2 吉祥草中β-胡萝卜素含量测定结果

  3 讨论

  实验中采用β-胡萝卜素对照品溶液进行紫外扫描,发现450nm处有最大吸收峰,故采用450nm作为本实验的检测波长。

  由于β-胡萝卜素对光、热、氧化酶的作用较为敏感,因此样品的处理采用避光、室温浸提,浸提液抽风橱内自然挥干,高效色谱柱温设定为20℃,以避免β-胡萝卜素的损失。

  对提取溶剂进行考察,比较了丙酮-石油醚(30~60℃)(1∶1v/v)的混合溶液和丙酮-石油醚(30~60℃)(20∶80v/v)的混合溶液浸提效果,结果丙酮-石油醚(30~60℃)(1∶1v/v)的混合溶液浸提的β-胡萝卜素分离较好,且β-胡萝卜素的含量也较高,故选择丙酮-石油醚(30~60℃)(1∶1v/v)的混合溶液作提取溶剂。

  对流动相的考察,比较乙睛∶甲醇(20∶80)[4]和乙睛∶甲醇∶乙酸乙酯∶三乙胺(80∶10∶10∶0.05)[7]的分离效果及出峰时间,[7]较[4]好,故选[7]作为流动相。

  不同产地的吉祥草中β-胡萝卜素含量变化范围较大,其中以紫云县产的吉祥草中所含β-胡萝卜素的含量最高。本实验说明对各地所产吉祥草进行β-胡萝卜素含量测定,对药品生产企业在选择原料方面是具有指导意义的。

【参考文献】
   [1] 鲍家科等.贵州省中药及民族药材质量标准原植(动)物彩色图鉴上册.贵州科技出版社.2009,150~151

  [2] 周欣 刘海等.吉祥草化学成分研究.中国中药杂志.2008,33(23)2793~2796

  [3] 王新超 杨亚军等. 天然胡萝卜素开发利用状况和设想.《广西植物》 2006,(3):23

  [4] 吴光斌. 反相高效液相色谱法法测定果蔬中β-胡萝卜素.食品工业科技,2005,(3):166~168

  [5] 张坤生等. 高效液相色谱法法测定红酵母细胞中的β-胡萝卜素.中国食品学报,2004,4(1):52~54

  [6] 雷绍荣、欧阳华学.反相高效液相色谱法测定芦荟中β-胡萝卜素含量.西南农业学报,2005,18(6):874~875

  [7] 吴鑫等.高效液相色谱法测定甘薯中β-胡萝卜素.中国卫生检验杂志,2006,16(9):1056~1057

  [8] 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].2005:附录ⅥB.

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