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化学发光法检测梅毒螺旋体抗体的临床研究

首席医学网      2012年07月21日 12:20:30 Saturday  
 
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作者:金建国1,马作新2,张晓静3    作者单位:(1.辽宁省抚顺市中医院检验科,辽宁 抚顺 113008;2.辽宁省人民医院检验科,辽宁 沈阳 110016;3.吉林大学中日联谊医院检验科,吉林 长春 130033)

【摘要】  目的:应用免疫印迹法(WB)比较临床常用的梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)与化学发光法(CLIA)检测血清梅毒螺旋体特异性抗体的符合率。方法:收集7 805份临床检测的血清标本,分别用TPPA和CLIA进行梅毒螺旋体特异性抗体检测,对结果不一致的标本应用WB检测确证。结果:7 805份血清标本中,CLIA检测阳性310例,TPPA检测阳性262例。对结果不一致的48例标本应用WB检测验证,结果证实阳性36例,临界阳性8例,阴性4例,而TPPA的结果均为阴性。TPPA检测总符合率为99.44%,CLIA检测总符合率为99.95%。结论:CLIA敏感性优于临床常用的TPPA,且具有结果客观、易分析、重复性好等优点,但也存在个别假阳性和钩状效应,因此应结合TPPA及临床资料确诊。

【关键词】  化学发光法;梅毒螺旋体明胶凝集试验;免疫印迹法;梅毒螺旋体特异性抗体

  梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema Pallidum,TP)感染引起的性传播疾病,具有高度传染性。近年来,梅毒发病率有不断上升趋势,并且已从高危人群向普通人群扩散[1]。梅毒的血清学检查也被卫生部列为输血前、术前等必查常规项目,梅毒的诊断依靠流行病学史、临床症状和体征及实验室诊断三方面信息,其中实验室诊断具有重要意义,它不仅是诊断梅毒必不可少的方法,也是判断疗效和复发的重要依据。梅毒的实验室诊断分为梅毒病原体检测和梅毒血清学检测,而不同试剂方法结果各异。梅毒螺旋体培养艰难,临床症状、对黏膜或皮肤破损样本的实验室检查和血清学结果是诊断梅毒的主要方法。因为皮损材料只在梅毒发病早期阶段可以获得,故对晚期阶段梅毒的主要实验室诊断工具是检测其特异性抗体,况且梅毒感染的自然病程是以存在潜伏期为特征的[2]。随着临床检验技术的不断发展,梅毒的血清学检测方法也得到了很大的改进,血清学检测梅毒螺旋体抗体是诊断梅毒的重要依据之一,它在梅毒的诊断、治疗及研究方面均有重要意义。因此,选择敏感性高、特异性强的实验室检测方法有助于梅毒的诊治。目前在我国大多数性病实验室都应用TPPA法作为梅毒螺旋体感染的确证试验,TPPA试剂价格昂贵,在临床应用上受到一定程度的限制,化学发光法为国内新开发的梅毒确证试剂,价格便宜,敏感性及特异性与临床符合率较高。本研究采用化学发光法对我院2008年7月~2010年6月间15 108例门诊及住院患者进行梅毒的血清学检测,对检出的216例阳性及随机抽取的300例阴性血清分别进行明胶凝集法(TPPA)、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及免疫印迹法(Western Blot,WB)的检测,现将结果报告如下。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料

  1.1.1 标本来源:我院2008年7月~2010年6月间15 108例门诊及住院患者,对检出的216例阳性及其中随机抽取的300例阴性患者进行研究,青年对照组(20~45岁)及老年对照组(46~85岁)各100例分别来自健康体检者,男女比例与研究组一致。

  1.1.2 主要试剂:试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司提供。

  1.2 实验方法:①分别吸取50 μl梅毒阳性对照和阴性对照均匀铺加在纸卡的两个圆圈中。②取待测血清或血浆50 μl(不需灭活)置于纸卡的另一圆圈中。③用试剂盒中提供的滴管及针头垂直分别滴加TRUST试剂1滴于上述血清中。④按100 r/min摇动8 min,肉眼观察结果。

  1.3 统计学方法:应用SPSS 12.0统计软件,显著性比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  本实验依据化学发光法检测梅毒螺旋体抗体结果(参考范围为:S/CO<1)将实验组分为化学发光法检测阳性组及化学发光法检测阴性组,将对照组分为青年对照组(20~45岁)及老年对照组(46~85岁)分别进行TPPA、TP(ELISA)、 TRUST及WB的检测,结果见表1。以免疫印迹法为确证实验分别与其它几种实验进行比较,结果表明TPPA及TP(ELISA)两种实验的结果比较差异有统计学意义(P<0.01);TRUST由于是非特异性检测方法未与免疫印迹法进行对比分析,其检测阳性率为51.89%,与化学发光组进行比较差异无统计学意义(P>0.05)。表1 不同方法检测梅毒螺旋体抗体的比较

  此外,将化学发光法检测梅毒螺旋体抗体的低S/CO(0.5~3.0)值者分为两组进行 TRUST结果的比较,结果见表2。 S/CO值为1.0~3.0者其TRUST效价为1∶64组阳性检出率为38.71%,TRUST效价为1∶128组阳性检出率为25.81%;S/CO值为0.5~1.0者其TRUST效价为1∶64组未见阳性标本检出,TRUST效价为1∶128组阳性检出率为4 %。 表2 化学发光法检测低S/CO值的TRUST结果比较

  3 讨论

  梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema Pallidum,TP)所致的性传播疾病,主要经性接触、母婴垂直传播、输血及其他密切接触传播。早期梅毒诊断方法,有利于指导临床及时治疗,对于控制梅毒的蔓延有重要意义。现阶段实验室有病原学、血清学、基因诊断和脑脊液等检查方法。梅毒旋体感染机体后,血清中可产生非特异性反应素抗体和梅毒螺旋体抗原的特异性抗体。

  检测感染者血清梅毒螺旋体是诊断梅毒螺旋体感染的主要办法。临床诊断梅毒血清学方法主要有两种:一是检测非梅毒螺旋体(NTP)抗体,如甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)等;一是检测梅毒螺旋体特异性抗体,如梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)、梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验(TP-ELISA)。

  TRUST可用来初步筛查梅毒感染,TRUST方便测定反应素滴度,反应素在初期梅毒病灶出现后1~2周就可测出,在二期梅毒滴度最高,三期梅毒较低。由于反应素对机体无保护作用,未经治疗的患者,其血清内的反应素可长期存在。经适当治疗后,抗体可以逐渐减少至转为阴性,其滴度变化与梅毒的治疗情况成正相关,因此适合用于疗效观察、随访和复发的辅助诊断以及基层医院应用。某些疾病可引起假阳性,如红斑狼疮、麻风、类风湿关节炎、混合结缔组织病等。所以TRUST用于梅毒螺旋体的诊断有很大的局限性。ELISA 法检测梅毒螺旋体抗体实验因为敏感性、特异性较高,并可在全自动酶免仪上批量处理,目前在临床上得到广泛使用。该实验在使用基因工程方法制备的重组多肽抗原代替以往使用的野生型梅毒螺旋体抗原后,抗原由于纯度高,理论上提高了实验的敏感性和特异性[3]。但双抗原夹心法测定TP-Ab中,基因工程混合多肽抗原TpN17(MW17 000)和TpN47(MW47 000)常用来包被微孔和酶标记物,为使小分子多肽能较好地吸附在微孔上,常使用人血清白蛋白作为桥联接,可能有针对人血清白蛋白抗原位点产生抗体或干扰蛋白而造成TP-Ab 假阳性的可能。本试验中老年组的阳性率和假阳性率都显著高于中青年组,可能与此原因有关,这也是与相关报道是相符的[4]。因为老年人的免疫功能衰退,容易产生一些针对联接用的白蛋白抗体或者是一些异常蛋白质干扰了TP-ELISA反应[5]。TPPA具有操作简便、不需其它仪器、操作中无需等待血液吸收、2 h读结果的优点,但价格相对昂贵,并且结果判断难以自动化,另外在患者伴硬下疳或生殖器官溃疡疑为TP感染时,首次检查可以为阴性,需隔1~2周重新复查[6]。

  免疫印迹法可检测到TP 的特异性蛋白抗原抗体,其中47KDa、45 KDa、17 KDa、15 KDa 蛋白为梅毒螺旋体外膜的脂蛋白,具有较好免疫活性[7]。免疫印迹法具有特异性强,敏感度高的优点,其敏感度比ELISA 法至少高2个稀释度[8],克服了ELISA 法和TPPA 法的不足,是目前理想的梅毒确认试验[9]。本次实验采用了较严格的判断标准,即出现针对TpN47(MW47 KDa)、tmpA (MW45 KDa)、TpN17(MW17 KDa)、TpN15(MW15 KDa)4种特异性抗原中2种及2种以上才判断为阳性结果。

  本研究采用化学发光法对近两年来我院就诊15 108例门诊及住院患者进行了梅毒的血清学检测,对检出的216例阳性及随机抽取的300例抗体阴性者进行了免疫印迹法的确证实验,结果表明化学发光法与WB法的符合情况很好,仅出现1例假阴性患者,其S/CO值0.61为本实验室提示建议随访患者;检出的4例假阳性患者的WB条带上分别出现了TpN47、 TpN17 、TpN15单一抗原及P22等非特异性抗原,分析可能是其中的个别片段与患者血清中的抗体发生了交叉反映的原故。本实验室选用的是由北京科美公司生产的化学发光试剂,为国内新开发的梅毒确诊试剂,其主要是采用一步法双抗原夹心免疫分析模式,使用多种梅毒螺旋体特异性蛋白抗原制备固相抗原,辣根过氧化酶(HRP)标记的相同蛋白作为标记抗原,与样品中的梅毒螺旋体抗体形成双抗原夹心。研究表明其敏感性和特异性都很高,而且适合大批量标本的筛查[10]。

  本文中TPPA法未检出阳性的24份血清标本,经临床证实11例为临床治疗后复查的梅毒患者,据分析出现这种情况可能是因为经过治疗后患者的梅毒非特异性抗体和特异性抗体明显下降或消失所致[11],其余13例由于未配合随访,因此未做分析。TP-ELISA因其方法学上存在敏感性较发光法低的因素,也即lumino标记要优于HRP标记的敏感性,因此可见化学发光法具有一定优势,必要时可作为TPPA法的补充实验[12]。虽然TPPA操作简单,但试剂价格昂贵,且耗时长,结果判定难以自动化,须依靠肉眼判断且不易保存,对操作者的水平要求较高,限制了其用于大规模标本的筛查[13]。化学发光法作为国内新开发的梅毒确证试剂在这些方面也给检测者提供了便利。

  本实验还检测了各组的TRUST情况,阳性组TRUST阳性率为51.88%;阴性组TRUST阳性率为1.34%,其与其它特异性实验符合率较差的原因是由于该实验检测的是心磷脂抗体,梅毒螺旋体感染后该抗体的出现晚于特异性抗体,潜伏期和初期梅毒患者血清可呈假阴性[14]。据报道,TRUST在Ⅰ期梅毒、Ⅱ期梅毒的检出率高达96%~100%[15],TRUST在Ⅰ期梅毒早期和晚期梅毒、晚期潜伏梅毒及治疗后梅毒可呈阴性,在一期潜伏期及晚期梅毒中检出率为58%~85%[16]。一般情况下TRUST可以作为治疗状况的监测,但有少数患者血清反应在规定随访时间内不阴转,这种现象称之为血清固定或血清抵抗,这主要是由于细胞免疫不平衡和抑制所造成的[17]。

  此外,本文还对56例发光法检测S/CO值在0.5~3.0之间的血清进行了TRUST的检测,结果表明在此范围内未检出滴度在1∶64以下的患者。一方面检测样本量较少不能片面断定不存在低滴度情况,另一方面也说明了在检测的灰区内要加强对病患的监测。梅毒的疗效监测用TRUST做滴度检测,是为了避免前带现象所致的假阴性的干扰,但部分研究仍提示:TRUST仅对二期梅毒的阳性率较高,而对一期、三期的阳性率较低,平均为80.18%,且特异性较差,在某些自身免疫性疾病、病毒感染、妊娠时均易产生假阳性结果[18]。非特异性抗体因其影响因素较多,将其滴度变化作为梅毒的疗效监测或随访有否复发或再感染的唯一血清学判断指标有一定的局限性,必须与梅毒特异性抗体的滴度变化联合观察才能更为准确、有效地判断病情及疗效[19]。

  梅毒血清学检查是诊断梅毒的重要依据,但不是唯一依据[14]。目前所谓的确证试验或确诊,实际上是梅毒螺旋体抗体的确证试验,而非梅毒确诊试验,梅毒的确诊实验应遵循卫生部《梅毒诊断和治疗标准》的有关规定。诊断梅毒除依据化验结果外,更要了解患者的临床表现、病史、生活史、即往史和接触史,综合分析后慎重做出判断。因实验室结果有一定的假阳性率和假阴性率,所以都只能做为诊断的参考依据,并要注意定期复查,才能避免梅毒化验结果假阳性或假阴性,造成误诊[20]。

  综上所述,对于临床疑为梅毒感染者,对梅毒的诊断应按照梅毒诊断标准及处理原则GB15974-1995规定:梅毒诊断必须根据病史、临床症状、体检及实验室检查等进行综合分析,慎重作出诊断。

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  [编校:费越/郑英善]

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