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B16F10黑素瘤细胞培养上清对同基因小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用

首席医学网      2010年07月15日 19:48:10 Thursday  
 
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作者:贾靖, 孙立新, 葛志华    作者单位:承德医学院附属医院, 河北 承德 067000

【摘要】    目的:研究B16F10黑素瘤细胞培养上清对同基因小鼠脾淋巴细胞的抑制作用。方法:制备B16F10黑素瘤细胞培养上清,作用于同基因小鼠脾淋巴细胞,通过PHA刺激和混合淋巴细胞反应,用MTT法检测淋巴细胞的增殖活性。结果:在B16F10黑素瘤细胞培养上清的作用下,PHA诱导的同基因小鼠脾淋巴细胞增殖率平均为63.00%,明显低于对照组,差异有显著性(t = 16.447,p = 0.000);混合淋巴细胞反应的淋巴细胞增殖率平均为61.82%,亦明显低于对照组,差异有显著性(t=8.097,P=0.000)。结论:B16F10黑素瘤细胞培养上清对同基因小鼠脾淋巴细胞的增殖具有抑制作用。

【关键词】  黑素瘤; 淋巴细胞; 增 殖; PHA; 混合淋巴细胞反应

  Suppressed Proliferation of Syngenic Mouse Spleen Lymphocytes in Vitro by Supernatant from B16F10 Cell Culture

  JIA Jing,  SUN Lixin,  GE Zhihua

  (The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)
       
  Abstract: Objective: To study the suppression effect on proliferation of syngenic mouse spleen lymphocytes in vitro by supernatant from B16F10 cell culture. Method: The supernatant from B16F10 cell culture was prepared and used on syngenic mouse spleen lymphocytes. The proliferations induced by PHA or MLR were determined by MTT assay. Result: Treating with supernatant from B16F10 cell culture, the proliferations of mouse spleen lymphocytes induced by PHA and MLR were 63.00% and 61.82% respectively. Both were lower than that of their controls with statistically significant differences (t=16.447, p=0.000 and t=8.097, p=0.000 respectively). Conclusion: The proliferation of syngenic mouse spleen lymphocytes was suppressed by supernatant from B16F10 cell culture.
   
  Key words:  Melanoma;  Lymphocyte;  Proliferation;  PHA;  MLR
           
  恶性肿瘤越来越成为危害人类健康的重要疾病。机体的免疫系统在机体抗肿瘤方面发挥着重要作用。但肿瘤细胞利用多种复杂的方式来逃避机体免疫系统的攻击[1]。肿瘤细胞免疫逃逸的分子机制与病毒类似。一般来讲,肿瘤采用两方面的策略来逃避机体免疫系统的攻击,一是隐蔽自己避免被免疫细胞识别,二是抑制或清除免疫细胞[2]。B16F10细胞是一种黑素瘤细胞,而黑素瘤是一种皮肤恶性肿瘤。研究B16F10细胞培养上清对淋巴细胞的抑制作用,有助于更多了解其免疫逃逸机制,并采取针对措施阻断其免疫逃逸,以提高免疫治疗的效果。

  1  材料与方法

  1.1  主要实验材料与试剂配制:PHA购自北京化学试剂公司, 用PBS配制成10mg/mL浓度备用。MTT为Biodee Biotechnology公司产品,用PBS配制成5mg/mL浓度备用。淋巴细胞分离液购自中国医学科学院血液学研究所。RPMI 1640 细胞培养液为Gibco产品, 胎牛血清购自中国医学科学院血液学研究所。BALB/c及C57BL/6j小鼠购自北京维通利华公司。B16F10细胞购自南京凯基生物技术有限公司。

  1.2  B16F10黑素瘤细胞培养上清的制备:0.25%胰酶消化B16F10细胞,制备细胞悬液,调整细胞浓度为2×104/mL,接种于50mL培养瓶中,每瓶10mL。细胞置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养致细胞长满瓶底80%时,换液,继续培养8h,收集培养上清,0.22μm滤纸过滤,-20℃保存用于后续实验。

  1.3  淋巴细胞增殖实验[3]:B16F10细胞为来源于C57BL/6j小鼠的黑素瘤细胞株,因此C57BL/6j小鼠为B16F10细胞同基因小鼠。无菌摘取C57BL/6j小鼠脾脏,常规制备脾细胞悬液, 淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,调整细胞浓度至2.5×108/mL。96 孔平底细胞培养板每孔预先加入196 mL B16F10细胞培养上清,再每孔加入上述淋巴细胞悬液4μL(1×106), 并以RPM I 1640 培养基作为对照。每孔加10mg/mL PHA 2μL使终浓度为100μg/mL,实验设8个平行复孔。将培养板置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养68 h,加入MTT 20μL/孔,继续培养4 h,以MTT法在酶标仪上测定490 nm波长下的光密度(OD),检测增殖情况。以对照组光密度值为标准将光密度值按下式转化为淋巴细胞增殖率:淋巴细胞增殖率=(OD样品/OD对照)×100%。

  1.4  混合淋巴细胞培养反应(MLR):采用双向混合淋巴细胞反应[4]。取96孔平底细胞培养板,每孔加入192μL B16F10细胞培养上清,并以RPMI 1640 培养基作为对照。再向每孔加入细胞浓度为2.5×108/mL的BALB/c及C57BL/6j小鼠的脾淋巴细胞各4μL(1 ×106细胞),共培养5d。培养结束后同样采用MTT法检测细胞增殖。

  1.5  数据统计分析:实验结果以均数±标准差(±SD)表示, 应用SPSS 13. 0统计软件进行统计分析。组间差异比较采用t检验,以P≤0.05为差异有显著性。

  2  结果

  2.1  B16F10黑素瘤细胞培养上清对PHA诱导的同基因小鼠脾淋巴细胞增殖的影响:小鼠脾淋巴细胞在B16F10黑素瘤细胞培养上清的作用下,对PHA诱导的淋巴细胞增殖明显受到抑制,增殖率仅为63.00%,明显低于对照组,差异有显著统计学意义(t=16.447,P=0.000),见表1。表1  PHA诱导的同基因小鼠脾淋巴细胞增殖率(略)

  2.2  B16F10黑素瘤细胞培养上清对混合淋巴细胞反应诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响:小鼠脾淋巴细胞在B16F10黑素瘤细胞培养上清的作用下,对混合淋巴细胞反应导致的淋巴细胞增殖明显受到抑制,增殖率仅为61.82%,明显低于对照组,差异有显著统计学意义 (t=8.097,P=0.000),见表2。表2  MLR诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖率(略)

  3  讨论
     
  黑素瘤是一种皮肤恶性肿瘤。恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病。虽然恶性肿瘤的治疗取得了巨大进步,但还未能从根本上解决问题。恶性肿瘤的治疗除手术、化疗、放疗外,免疫治疗也越来越受到关注。
     
  恶性肿瘤的免疫治疗主要包括主动免疫治疗和过继免疫治疗。主动免疫治疗是指用各种方法提高肿瘤抗原的免疫原性,并将这种肿瘤抗原引入体内起到解除肿瘤免疫耐受、刺激淋巴细胞活化,生成效应细胞杀伤肿瘤的治疗方法[5]。过继免疫治疗是指体外刺激、扩增肿瘤特异性的免疫效应细胞,并将这种扩增的免疫效应细胞输入病人体内发挥抗肿瘤作用的治疗方法[6]。两种免疫治疗都致力于通过体内或体外措施来诱导有效的抗肿瘤免疫反应,从而达到治疗肿瘤的目的。但肿瘤细胞也通过多种途径逃避机体的抗肿瘤免疫反应,其中肿瘤细胞通过多种机制抑制机体的抗肿瘤免疫功能是其免疫逃逸的重要方面。肿瘤细胞不仅可以释放多种多样的可溶性的抑制因子,如转移生长因子β(TGF-β)[7]、IL-10[8,9]、前列腺素 E2 (PGE2)[10]、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)[11]、抑制配体[12]FasL或TRAIL等来抑制机体的免疫功能,还可促进调节性T细胞(CD4+CD25+)等免疫抑制细胞的生成,从而起到重要的抑制机体抗肿瘤免疫功能的作用。因此,获得有效的抗肿瘤免疫反应,必须研究和探索肿瘤的免疫抑制机制,从而有效地阻断或解除这种免疫抑制,以达到理想的免疫治疗效果。
     
  本研究根据肿瘤细胞培养上清中含有多种免疫抑制因子的情况,利用B16F10黑素瘤细胞培养上清作用于同基因小鼠的脾淋巴细胞,观察其对淋巴细胞的抑制作用。结果显示,B16F10黑素瘤细胞培养上清对同基因小鼠脾淋巴细胞具有明显抑制作用。与对照组相比,PHA刺激的淋巴细胞增殖率和混合淋巴细胞反应诱导的淋巴细胞增殖率均明显降低。结果表明,B16F10黑素瘤细胞分泌了可溶性因子直接抑制了淋巴细胞的功能或通过诱导生成了调节性T细胞等免疫抑制细胞而间接抑制了淋巴细胞的功能。因此,探索有效方法阻断黑素瘤细胞对淋巴细胞的免疫抑制作用,对于取得理想的抗肿瘤免疫治疗效果将起到重要作用。

【参考文献】
    [1]Lybarger L, Wang X, Harris M, et al. Viral immune evasion molecules attack the ER peptide-loading complex and exploit ER-associated degradation pathways[J]. Curr Opin Immunol,2005,17(1):71-78.

  [2]Theresa L,Whiteside. Immune suppression in cancer: Effects on immune cells, mechanisms and future therapeutic intervention[J]. Seminars in Cancer Biology,2006,16(1):3-15.

  [3]Wang Y.Y., Khoo K.H., Chen S.T., et al. Studies on the immuno-modulating and antitumor activities of Ganoderma lucidum (Reishi) polysaccharides: functional and proteomic analyses of a fucose-containing glycoprotein fraction responsible for the activities[J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry,2002, 10(4): 1057-1062.

  [4]O’Leary J, Reinsmien N, Yunis E J. Mixed lymphocyte reaction. In: Rose NR, Friedman H. Manual of Clinical Immunology [M ]. Washington: American Society for Microbiology, 1976. 820-832.

  [5]Mocellin, S. Mandruzzato S, Bronte V, et al. Vaccines for solid tumours[J]. Lancet Oncol,2004, 5(11):681-689.

  [6]Yee, C. Adoptive T cell therapy: addressing challenges in cancer immunotherapy[J]. Transl Med,2005, 3(1):17.

  [7]Akhurst RJ, Derynck R. TGF-beta signaling in cancer: a double edged sword[J]. Trends Cell Biol,2001, 11(11):44-51.

  [8]Mocellin S, Marincola F, Rossi CR, Nitti D, et al. The multifaceted relationship between IL-10 and adaptive immunity: putting together the pieces of a puzzle[J]. Cytokine Growth Factor Rev,2004,15(1):61-76.

  [9]Vicari AP, Trinchieri G. Interleukin-10 in viral diseases and cancer: exiting the labyrinth[J]. Immunol Rev,2004,202(1):223-236.

  [10]Uotila P. The role of cyclic AMP and oxygen intermediates in the inhibition of cellular immunity in cancer[J]. Cancer Immunol Immunother,1996,43(1):1-9.

  [11]Grohmann U, Fallerino F, Pucetti P. Tolerance, DC and tryptophan: much ado about IDO[J]. Trends Immunol,2003,24(5):242-248.

  [12]Whiteside TL. Tumor-induced death of immune cells: its mechanisms and consequences[J]. Semin Cancer Biol,2002,12(1):43-50.

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