放射治疗诱发老年大鼠认知功能障碍的研究
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首席医学网
2009年10月27日 12:55:10 Tuesday
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作者：陈齐鸣 温伟 Joannis Lamproglou Jean-yves Delattre 作者单位：233004 蚌埠市 蚌埠医学院第一附属医院神经内科
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【摘要】 目的 为了建立一种放射治疗诱发的行为障碍的大鼠动物模型。 方法 将26只16～27个月老年Wistar大鼠进行一个疗程的全脑放射治疗(30Gy/10次/12天)，26只Wistar大鼠对照组接受了假性放射治疗。放射治疗后进行连续的行为学研究，包括单向逃避、双向逃避、按压踏板逃避测试以及水迷宫测试。 结果 在放射治疗前两组结果相似，放射治疗后1～3个月两组结果没差别，而放射治疗后6～7个月，接受放射治疗的大鼠单向逃避(23%：55%，P≤0.001)和双向逃避(18%：40%，P≤0.01)测试与对照组相比有显著差异。放射治疗后7个月踏板逃避测试反应时间与对照组相比显著增高(11.20 s：8.43 s，P≤0.05)，水迷宫正确反应百分比显著降低(53%：82%)。在光镜下未发现放射治疗后的大鼠大脑有病理异常。 结论 老年鼠接受常规放射治疗后，可以发生主要累及记忆的行为功能的障碍。这种动物模型可用于放射治疗诱发的认知功能障碍的病理机制的研究。
【关键词】 颅脑照射;学习;记忆;老年大鼠
Radiation-induced cognitive dysfunction-an experimental model in the old rat
Chen Qiming1， WenWei1, Joannis Lamproglou2， Jean-Yves Delattre3
1 Department of Neurology,the Fist Affiliated Hospital of Bengbu medical College,Bengbu 233004
2 Laboratoire de Biophysique,Faculté de Médecine Xavier Bichat,Paris,France
3 Department of Neurology Hospital de la Salpêtrière,Paris,France
[Abstract] Objective To develop a model of radiation-induced behavioral dysfunction. Methods A course of whole brain radiation therapy(30Gy/10 fractions/12 days)was administered to 26 Wistar rats ages 16~27 months,while 26 control rats received sham irradiation.Sequential behavioral studies including one-way avoidance,two-way avoidance,and a standard operant conditioning method(press-lever avoidance) were undertaken.In addition,rats were studied in a water maze 7 months postradiation therapy. Results Prior to radiation therapy,both groups were similar.No difference was found 1 and 3 months postradiation therapy.At 6-7 months postradiation therapy,irradiated rats had a much lower percentage of avoidance than controls for one-way avoidance (23% vs 55%,P≤0.001)and two-way avoidance(18% vs 40%,P≤0.01).Seven months postradiation therapy the reaction time was increased (press-lever avoidance,11.20 s vs 8.43 s,P≤0.05)and the percentage of correct response was lower (water maze,53% vs 82%)in irradiated rats compared with controls.Pathological examination did not demonstrate abnormalities of the irradiated brains at the light microscopic level. Conclusion Behavioral dysfunction affecting mainly memory can be demonstrated following conventional radiation therapy in old rats.This model can be used to study the pathogenesis of radiation-induced cognitive changes.
[Key words] Cranial irradiation;Learning;Memory;Elderly rats
Laboratoire de Biophysique,Faculté de Médecine Xavier Bichat,Paris,Frace(Joannis Lamproglou)
Department of Neurology Hospital de la Salpêtrière,Paris,France(Jean-yves Delattre)
颅脑放射治疗可引起儿童的认知功能障碍已得到大家公认[1，2]，近年来研究提示颅脑放射治疗也常常诱发成年人的智力障碍[3~5]。10%~60%小细胞肺癌患者经过颅脑放射和化疗联合治疗以后，可产生迟发性的认知功能障碍[6，7]。50岁以上的脑肿瘤患者，经颅脑放射治疗以后，20-50%的长期生存者可产生颅脑放射治疗诱发的痴呆[3，8]。颅脑放射治疗诱发晚发性的认知功能障碍的病理机制了解甚微，少数报道可产生放射性白质脑病，或者病理检查阴性[3]。为了建立一个放射治疗后的实验动物的模型，我们以老年Wistar大鼠为研究对象，探讨颅脑放射治疗后的长期行为障碍和病理改变。
1材料与方法
52只成年雄性Wistar大鼠约为16~27个月龄，体质量500～780 g，分为两组。照射组26只，其中20只为16~18个月龄，6只为27个月龄;对照组26只，其中18只为16~18个月龄，8只为27个月龄。
1.1 颅脑放射治疗方案 Wistar大鼠置于俯卧位用激光校准，采用水合氯醛250 mg/kg下腹部皮下注射进行麻醉，用60钴远距离治疗机进行颅脑照射，总剂量30 Gy/10次/12天。采取双侧平行对穿野，照射野8 cm×8 cm大小，距离60钴源的轴线距离为80 cm，采用国际辐射测量和单位委员会(ICRU)95%的等剂量曲线，每天双野照射，口腔咽喉部、鼻窦和副鼻窦用铅块挡铅，铅块置于治疗台上，尽量靠近Wistar大鼠的皮肤，减少半影区宽度。在颅脑放射治疗之前，使用治疗计划系统测算剂量。对照组每天也进行麻醉，接受假性的颅脑照射，放射治疗后的大鼠在理想的实验室条件下喂养，每星期进行检查。
1.2 行为学测试 由一位医学博士和一位生理学博士担任放射治疗前和放射治疗后Wistar大鼠行为学的多向测试，测试者不知哪些大鼠接受过放射治疗。自发性行为学测试(open field)，测试每日早晨9时至11时测试，每只大鼠放置于Plexiglas box，最初3 min进行新环境的探查，Wistar大鼠的水平运动由两排3 cm高度的15个互相垂直的红外线光束监测，自动记录下列的参数：①行走运动次数;②垂直运动(理毛、搔抓)次数;③改变位置次数;④竖立运动次数，这项测试在放射治疗前及放射治疗后一个月各进行一次。
1.3 神经系统检查 对所有Wistar大鼠进行详细的量化神经系统检查[9]，正常的大鼠最高分为22分，这项测试在放射治疗前和放射治疗后的一个月各进行一次。
1.4 学习测试
1.4.1 单向逃避测试(One-way avoidance) 实验笼子由两个隔间组成(隔间A和隔间B)，每次测试时大鼠被放在隔间A，开始时由峰鸣器发出300 Hz的声音持续3 s，峰鸣器停止后底部铁丝格栅出现0.8 mA电流，持续15 s，大鼠如果逃避到隔间B就可避免电击，两次测试时间间隔40 s，在这期间两隔间门是关闭的。在放射治疗前，每天测试10次，连续5 d，使所有的Wistar大鼠能达到70%正确反应能力，并将逃避疼痛刺激的平均百分比进行记录。在放射治疗后1、3、6个月时，进行一天10次回顾性的测试。
1.4.2 双向逃避测试(Two-way avoidance) 双向逃避测试实验笼子和单向的相同，把Wistar大鼠交替放入隔间A或隔间B，每次测试按次数有序交替，测试开始时由峰鸣器发出300 Hz的声音持续4 s，峰鸣器停止后底部铁丝格栅出现0.8 mA电流，持续15 s，两次测试时间间隔50 s，在这期间两隔间门是关闭的。放射治疗后一个月连续测试5 d，15次/d，在放射治疗2.5、4.5、7个月后重复测试一次。
1.4.3 踏板逃避测试(press-lever) 在放射治疗后三个月，将大鼠置入“Skinner box”，每次测试开始时由峰鸣器发出300 Hz的声音持续3 s，并在两个踏板之上有两个灯光刺激，大鼠如果在声音出现后4 s期间，大鼠用前脚能够踏住一个踏板，就可终止电流，否则峰鸣器停止后间隔1秒底部铁丝格栅出现0.8～1.1 mA电流，持续15 s，两次测试时间间隔50 s，在通电期间，大鼠如果踏住其中一个踏板，就可终止电击。在放射治疗后3个月，将大鼠连续培训8 d，15次/d，并记录平均反应时间;放射治疗后5、7个月重复测试一次，每次一天，15次/d，以测试大鼠的记忆。
1.4.4 水迷宫：空间导航测试(spatial navigation task)
将放射治疗后7个月的大鼠放置Plexiglas box水池，水池直径120 cm、高50 cm、深40 cm、水温保持25 ℃，每天1次，每次10 min，连续测试6 d，10 min之内大鼠找不到平台就计算失败，在第6 d，计算正确反应的百分比。
1.5 病理学检查 取放射治疗组和对照组大鼠各两只，在苯巴比妥麻醉下立即取出大脑，用40%甲醛固定石蜡包埋后，与脑干和小脑纵轴垂直，做额顶叶的冠状7 μm连续切片，行苏木精-伊红染色。轴索及髓鞘采用Bodian银染色法和Luxol fast blue染色。
1.6 统计学 在两组之间的比较采用Student's t-test方法。
2 结果
2.1 自发性行为学检查和神经系统检查 在放射治疗前和放射治疗后一个月，两组之间未发现自发性行为学测试和神经系统检查有差异(表1)。
2.2 单向逃避测试 在放射治疗前两组大鼠均达到70%正确反应比例，在放射治疗后1个月第1次回忆测试，两组逃避测试正确反应百分比同时下降;在放射治疗后3个月第2次回忆测试时，对照组的正确反应百分比仍然保持稳定，而放射治疗组的正确反应能力开始下降;在放射治疗后6个月第3次回忆测试时，放射治疗组(23%±3.92%)与对照组(55%±7.65%)相比，单向逃避测试正确反应百分比显著下降(P≤0.001)(表2，图Fig.1.)。
2.3 双向逃避测试 这项测试仅在放射治疗后进行，在放射治疗后1个月(学习阶段)、2.5个月(第1次回忆)时，放射治疗组逃避平均正确反应百分比低于对照组，但数值并没有统计学意义。放射治疗组在放射治疗后4.5月(第2次回忆，12.4%±2.96%)、7个月(第3次回忆，18%±3.75%)时，与对照组4.5个月(27%±5.96)、7个月(40%±6.75%)相比有显著意义(第2次回忆P≤0.05、第3次回忆P≤0.01)。(表2，图Fig.2.)
Fig.1.Significant difference between RT(*P<0.001) and control rats 6 months posttherapy . Abbreviations：LDP-last day of performance;M-months;AT-pretherapy;PT-posttherapy . Data are mean±SEM (Student's t-test).
Fig.2.Significant difference in RT compared to control rats 4.5 months (***P<0.05)，7 months(**P<0.01) posttherapy.Abbreviations：LDP-last day of performance;M-months;PT-posttherapy.Data are mean±SEM (Student's t-test).
2.4 踏板逃避测试 这项测试仅在放射治疗后进行，放射治疗后3个月(学习阶段)，对照组很快获得正确反应结果，在训练的第8 d，平均反应时间达到7.74±0.47 s;放射治疗组反应时间延长12.29±3.14 s，但数值没有达到统计学意义，在放射治疗后5、7个月回忆测试时，放射治疗组反应时间仍然延长，与对照组相比有统计学意义(P≤0.05)(表2、图Fig.3.)。
Fig.3.Significant difference in RT compared to control rats 5 and 7 months(***p<0.05) posttherapy . Abbreviations：LDP-last day of performance;M-months;PT-posttherapy. Data are mean±SEM (Student's t-test).
2.5 水迷宫测试 这项测试在放射治疗后7个月后进行，放射治疗组正确反应能力为52.63%，对照组为81.82%，但没有达到统计学意义。
2.6 病死率统计 在实验结束时候，对照组病死率达到50%，放射治疗组达到15%(P≤0.03)。
2.7 病理 在光镜下，放射治疗组的大脑没有发现异常，白质和轴突显示正常，也没有炎症和胶质细胞反应，脑膜、血管间质、灰质未见异常。
3 讨论
在此项研究中，老年大鼠接受一个疗程的常规全脑照射剂量，相当于肿瘤患者临床实际应用剂量(30Gy/10次/12天)，在放射治疗后7个月期间，对放射治疗组及对照组的大鼠进行了一系列的行为学测试和研究。结果显示，一个疗程常规放射治疗可诱发大鼠进行性的学习和记忆功能障碍，在放射治疗前两组大鼠单向逃避测试显示学习和记忆功能正常。放射治疗后，在所有需要学习记忆的测试过程中，例如，双向、踏板和水迷宫逃避测试中，放射治疗组与对照组相比，显示操作能力下降。
在这项研究中，最显著的发现是大鼠记忆功能下降，在单向、双向、踏板逃避测试回忆过程中，放射治疗组的执行能力较差。单向逃避测试中，放射治疗后1、3个月第1次和第2次回忆测试中，两组大鼠结果相似，然而在放射治疗后6个月的回忆测试中，放射治疗组与对照组相比，执行能力显著下降，回忆能力严重受损，两组相比有显著的差别(P<0.001)。我们还发现在放射治疗后6～7个月，在单向、双向、踏板逃避的回忆测试中，放射治疗组的大鼠记忆功能障碍随着时间推移越来越严重，与对照组相比，其结果出现了很大的差别和显著的意义。
对照组的病死率高于放射治疗组，可能为研究中的一种偏倚，既往研究中也发现这种现象[10]。假如对照组大鼠在测试过程中已经“生病”，然而它们的良好操作执行功能对我们研究结果更具有说服力。另外，假如把测试过程中所有死亡的大鼠结果剔除时，我们的结果并没有受到影响。因此，我们的研究结果显示单独常规放射治疗可诱发大鼠行为功能障碍，且这种功能障碍随着时间推移进行性加重。
既往多项研究已经证实，对17~18天较年轻大鼠进行颅脑放射治疗加甲氨喋呤为基础的化疗后，可以诱发行为功能障碍[11，12]，但单独应用一个疗程的颅脑常规放射治疗后，是否可诱发行为功能障碍尚未见报道。在前期研究工作中，我们对45 d鼠龄Wistar大鼠进行一个疗程的常规颅脑放射治疗(30 Gy/10次/12天)，治疗后10～13个月进行上述相同的行为学测试，放射治疗组并没产生学习和记忆功能障碍[13]。我们认为这次成功建立放射治疗诱发的认知功能障碍的大鼠模型，主要原因是放射治疗时间段选择在大鼠的老龄阶段。
上述结果可能与肿瘤患者放射治疗诱发的痴呆有关，在颅脑放射治疗后，数月至数年过程中，大多数为1年之内，在肿瘤没有复发部分患者中，可产生记忆功能障碍和需要注意力集中的学习操作功能障碍，这种综合征可进展为痴呆。放射治疗后的这种并发症显著的易感因子为老龄患者[3]。目前这种综合征的病理机制了解甚微，弥漫性的白质脑病可能为最常见的原因。本组研究中在光镜下并没发现任何异常，但不足之处是病理分析的Wistar大鼠数量较少，所以需要更详细的病理学研究。另一方面，我们发现的行为损害反应的可能是一种功能损害而不是病理改变。我们先前研究中发现，利用14C脱氧葡萄糖定量放射自显影法，常规颅脑放射治疗1年后的大鼠额叶皮层的局部糖代谢下降20%，但病理学也未发现异常[14]。总之，这种颅脑放射治疗诱发的认知功能障碍动物模型对于今后探讨放射治疗诱发的痴呆的病理机制具有十分重要的意义。
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