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大肠埃希菌连续分离株耐药表型及复方磺胺甲口恶唑耐药相关基因研究

首席医学网      2009年04月08日 15:28:13 Wednesday  
 
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作者:王伟 糜祖煌 毛剑锋 徐伟珍    作者单位:1 丽水市人民医院,浙江丽水323000; 2 无锡市克隆遗传技术研究所, 无锡214026

【摘要】  目的 了解临床分离的大肠埃希菌耐药性和复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)耐药相关基因存在状况。方法 测定临床连续分离的60株大肠埃希菌对19种抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应(PCR)检测SMZ/TMP耐药相关基因(sul1、dfrA1、dfrA17)。结果 60株中sul1、dfrA1、dfrA17基因阳性分别为34株(56.7%)、1株(1.7%)、35株(58.3%)。结论 临床分离的大肠埃希菌多重耐药严重;复方磺胺甲口恶唑耐药相关基因携带率高。

【关键词】  大肠埃希菌; 复方磺胺甲口恶唑; 耐药基因

Study on drug resistance phenotype and drug resistancerelated

    trimethoprimsulfamethoxazole genes in continuous isolates

    from Escherichia coli

    Wang Wei1,  Mi Zuhuang2,  Mao Jianfeng1  and  Xu Weizhen1

    (1 Lishui People′s Hospital,  Lishui 323000;

    2 Wuxi Clone GenTech Institute,  Wuxi 214026)

    ABSTRACT  Objective  To investigate the drug resistance and drug resistancerelated trimethoprimsulfamethoxazole genes in Excherichia coli.  Method  Microdilution tests were performed to detect susceptibility of 60 strains of Escherichia coli to 19 antimicrobial agents and drug resistancerelated trimethoprimsulfamethoxazole were detected by PCR.  Result  The positive rates of sul1, dfrA1 and dfrA17 genes in 60 clinical strains of Escherichia coli were 56.7%, 1.7%, 58.3%, respectively.  Conclusions  There are multipledrug resistance and high positive rate of drug resistancerelated trimethoprimsulfamethoxazde genes in Escherichia coli isolated from the hospital.

    KEY WORDS  Escherichia coli;  Trimethoprimsulfamethoxazole;  Resistant genes

      多年来,大肠埃希菌(Escherichia coli,EC)一直是医院感染的重要病原菌之一。EC菌对β内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物出现多重耐药性,相关耐药基因研究已有报道。经检索国内尚无EC菌的复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)耐药相关基因报道。我们对60株连续分离株EC菌进行了药敏表型检测,并进行了SMZ/TMP耐药相关基因sul1、dfrA1、dfrA17检测,现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  菌株来源    60株EC菌均分离自2006年08月~2006年12月间丽水市人民医院住院患者临床标本,其中痰液10例,尿液24例,血液2例,分泌物24例(脓液15例、腹水4例、引流液3例、咽拭子2例)。全部菌株用BioMerieux ATB细菌鉴定仪鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。

    1.2  抗菌药物敏感性试验

    用微量肉汤稀释法测定19种抗菌药物的敏感性,并根据美国CLSI 2006年版要求进行敏感性判断。

    1.3  细菌处理    挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl),56℃水浴2h,然后95℃水浴10min,加入Chelex 100树酯40μl,离心(15000r/min)30s。上清液即为基因检测的模板液,-20℃冰箱保存备用。

    1.4  基因检测

    用聚合酶链反应法(PCR)进行检测。PCR引物序列见表1。PCR扩增体系为:每反应体系P1、P2引物各0.5μmol,dNTPs各200mmol,KCl 10mmol,(NH4)2SO4 8mmol,MgCl2 2mmol,TrisHCl(pH9.0) 10mmol,NP40 0.5%,BSA 0.02%(wt/vol),Taq DNA pol 1U;总反应体积20μl(其中模板液5μl)。热循环参数为:93℃预变性2min,然后93℃30s→55℃30s→72℃60s,循环35周期,再72℃延伸5min。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供(表1)。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外凝胶电泳成像仪下观察,并纪录结果。表1 sul1、dfrA1、dfrA17基因PCR引物序列及产物长度

    2  结果

    2.1  药敏试验结果

    60株EC菌连续分离株对亚胺培南和美罗培南敏感。对头孢他啶、阿莫西林/克拉维酸、头孢西丁、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/三唑巴坦等6种抗菌药物的敏感率在53.3%~95%;对头孢噻肟、头孢呋辛、妥布霉素、庆大霉素、环丙沙星、哌拉西林、阿莫西林和替卡西林等8种抗菌药物的耐药率在50%~90%。对复方磺胺甲口恶唑的耐药率为66.7%。

    2.2  sul1、dfrA1、dfrA17基因

    sul1、dfrA1、dfrA17基因阳性率分别为56.7%(34/60)、1.7%(1/60)、58.3%(35/60)。有35株检出dfrA基因(58.3%),40株检出sul和(或)dfrA基因(66.7%)。图1为sul1基因PCR产物电泳图。dfrA17基因PCR产物经测序与美国GenBank核酸数据库 (www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)中已登录的dfrA17基因序列完全一致。

    3  讨论

    EC菌广泛分布于自然界、健康人的皮肤、肠道和呼吸道。正常情况下,EC菌并不感染人体的任何组织,但当人体免疫力降低、长期大量使用广谱抗菌药物或创伤性医疗操作等情况下易引起内源性感染。EC菌所致感染中以泌尿道感染、呼吸道感染、菌血症等最常见。

    复方磺胺甲口恶唑为磺胺甲基异口恶唑(sulfamethoxazole,SMZ)与甲氧苄胺嘧啶(trimethoprim,TMP)的复合制剂,磺胺的抑菌机制为与化学结构相似的对氨苯甲酸(PABA)竞争二氢叶酸合成酶(DHPS),使二氢叶酸合成减少;甲氧苄胺嘧啶能抑制二氢叶酸还原酶(DHFS),使四氢叶酸的生成受阻。磺胺药与甲氧苄胺嘧啶合用后,分别作用于细菌叶酸合成的不同环节,因而有协同作用[1]。近年来,对细菌的可移动性遗传元件研究发现,I类整合子的耐药基因盒中常携带二氢叶酸合成酶的编码基因sul1,有些同时还携带二氢叶酸还原酶的编码基因dfrA(早期文献中以dhfr表示)[2~4]。细菌额外获得sul1基因,所表达的二氢叶酸合成酶抵消了磺胺与PABA竞争性抑制作用,导致细菌耐磺胺。细菌额外获得dfrA基因,所表达的二氢叶酸还原酶补充了甲氧苄胺嘧啶靶位酶,导致细菌耐甲氧苄胺嘧啶。

    为了解EC菌复方磺胺甲口恶唑耐药相关基因存在状况,我们根据美国GenBank核酸数据库中已发布的肠杆菌I类整合子基因序列,自行设计了sul1、dfrA1、dfrA17基因PCR扩增引物。结果显示有40株检出sul和(或)dfrA基因(66.7%),表型与基因型基本相符。对临床连续分离EC菌的复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)耐药相关基因的专题研究国内为首次报道。

    1996年,在O139群霍乱弧菌中发现一种整合性接合元件,该元件整合于细菌染色体上(长约100kbp)编码对磺胺甲基异口恶唑与甲氧苄胺嘧啶的抗性,被称为SXT元件[5]。SXT元件不仅存在于霍乱弧菌中,其它细菌内也有发现[6]。EC菌是否存在SXT元件需要进一步研究。

【参考文献】
  [1] 汪复. 抗菌药物作用机制和细菌耐药性[M]//闻玉梅主编. 精编现代医学微生物学.上海:复旦大学出版社,2002:306~307.

[2] Lee J C, Oh J Y,Cho J W, et al. The prevalence of trimethoprimresistanceconferring dihydrofolate reductase genes in urinary isolates of Escherichia coli in Korea [J]. J Antimicrob Chemother,2001,47(5):599~604.

[3] Lindstedt B A, Heir E, Nygard I, et al. Characterization of class I integrons in clinical strains of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Typhimurium and Enteritidis from Norwegian hospitals [J]. J Med Microbiol,2003,52(Pt 2):141~149.

[4] Cabrera R, Ruiz J, Marco F, et al. Mechanism of resistance to several antimicrobial agents in Salmonella clinical isolates causing traveler′s diarrhea [J]. Antimicrob Agents Chemother,2004,48(10):3934~3939.

[5] Waldor M K, Tschape H, Mekalanos J J. A new type of conjugative transposon encodes resistance to sulfamethoxazole, trimethoprim, and streptomycin in Vibrio cholerae O139 [J]. J Bacteriol,1996,178(14):4157~4165.

[6] Burrus V, Marrero J, Waldor M K. The current ICE age: Biology and evolution of SXTrelated integrating conjugative elements [J]. Plasmid,2006,55(3):173~183.

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