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纳他霉素HPLC检测波长的优化

首席医学网      2009年04月08日 15:42:36 Wednesday  
 
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作者:蔡秀云 王普 杨仲毅    作者单位:1 浙江工业大学药学院, 杭州310014; 2 浙江海正药业股份有限公司, 台州318000; 3 江南大学, 无锡214122

【摘要】  目的 确定纳他霉素HPLC检测的最佳波长,探讨分光光度扫描与HPLC测定之间的关系。方法 将含量为1~2000μg/ml的纳他霉素甲醇溶液进行全波长扫描,分析各波长下不同浓度范围的线性关系,确定线性关系最佳的波长作为HPLC的检测波长,并测定该波长条件下的理论塔板数、线性范围、精密度、稳定性和回收率。结果 USP26版规定的纳他霉素HPLC检测波长是303nm,但不同浓度下纳他霉素的全波长扫描发现,800μg/ml以下浓度的纳他霉素在303nm处R2为0.383,250nm处为0.993。将纳他霉素HPLC检测波长调整为250nm后,5~2000μg/ml范围内的R2为0.99995;同样条件下303nm处R2达到0.99以上的浓度范围仅为5~200μg/ml。结论 250nm是纳他霉素HPLC检测更合适的波长;全波长扫描时线性关系分析比简单地采用最大吸收波长对HPLC检测波长的选择具有更好的指导性和实用价值。

【关键词】  纳他霉素; 高效液相色谱; 波长

纳他霉素(1)为多烯大环内酯类抗真菌抗生素,是一种重要的生物防腐剂[1]。其测定方法有分光光度计分析、比色法分析、微生物分析、滴定分析、纸色谱分析、薄层色谱分析和HPLC分析[2~4]。其中HPLC法的分离度好,能精确定量,分析时间短,是应用最多的方法。

    USP26版规定的HPLC分析方法以303nm为检测波长[5]。本公司在产品开发过程中发现,该方法适于检测较低浓度的1,检测较高浓度时则存在较大的误差。本文通过系列浓度的1全波长扫描发现,303nm是线性范围最窄的波长,是造成HPLC分析方法误差的最重要原因。选择合适的波长,可以扩大线性范围。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    (1)设备  UV2550分光光度计(Shimadzu);1100型高效液相色谱仪(Agilent公司,包括1100型四元泵,G1314A型紫外检测器,G1316A型柱温箱,G1329A型恒温自动进样器,工作站)。    (2)试剂  1样品(本公司生产,批号070703),乙酸铵、氯化铵为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司,色谱纯乙腈购自Merck KGaA公司,分析纯甲醇购自Fischer Scientific公司。

    1.2  方法

    (1)全波长扫描  准确称取1 200mg,无水甲醇溶解并定容至100ml,分别以甲醇稀释成1500、1000、800、500、400、200、100、80、40、20、10、8、4、2和1μg/ml,以甲醇为对照进行190~450nm的波长扫描。

    (2)HPLC测定

    HPLC条件  色谱柱大连伊利特Hypersil ODS2(4.6mm×250mm,5μm);流动相为乙酸铵3.0g/L、氯化铵1.0g/L、四氢呋喃5.0ml/L和乙腈240ml/L。柱温30℃;流速0.8ml/min;进样量10μl。

    线性关系实验  准确称取1 200mg,无水甲醇溶解并定容至100ml,分别以甲醇稀释成1600、1200、1000、800、400、200、100、50、10和5μg/ml,取样HPLC测定,检测波长为303nm或250nm。    精密度实验  取800、200、50μg/ml的1样品,分别HPLC连续测定5次,检测波长为250nm。

    回收率实验  取800μg/ml的1样品甲醇稀释1倍后作为对照,以800μg/ml的1样品分别与400和1000μg/ml的1样品1∶1混匀,作为加样200和500μg/ml的样品,三者在250nm分别连续HPLC检测3次。

    稳定性实验  取800μg/ml的1样品,4℃避光保存,分别在0、3、11、13、16h取样HPLC测定,检测波长为250nm。

    2  结果

    2.1  HPLC检测波长的确定

    (1)全波长扫描  2000、1500、1000、800、500、400、200、100、80、40、20、10、8、4、2、1μg/ml的1在190~450nm波长进行扫描(图1)。

    (2)全波长线性范围分析  根据2.1(1)扫描结果,分别求出190~350nm波长范围内,1~100、1~200、1~400、1~500、1~800、1~1000、1~1500、1~2000μg/ml各浓度范围的线性系数,并把R2对波长作图,得到各浓度范围全波长线性关系(图2)。

    图1    纳他霉素全波长扫描

    图2    纳他霉素全波长线性关系图

    从图2可以看出,330~340nm波段对除1~2000μg/ml外的各浓度范围线性关系均较好,但该波段是紫外与可见光的交叉波段,浓度降低线性关系也下降。在245~255nm波段,线性关系随着浓度降低而加强,即浓度小于1000μg/ml时,可以确保R2大于0.995,因此既有利于高浓度的测定,也有利于极低浓度的测定。

    2.2  HPLC测定验证

    (1)303nm与250nm条件下HPLC测定线性范围比较  根据HPLC测定结果,得到不同波长下浓度与峰面积的线性曲线。

    在303nm,5~200:

    y=0.0155x-1.938  r2=0.9995

    在303nm,5~2000:

    y=0.0291x-118.04  r2=0.9418

    在250nm,5~200:

    y=0.2586x-1.7784  r2=0.9998

    在250nm,5~2000:

    y=0.2495x+2.9316  r2=0.99995

    即在250nm处低浓度与高浓度的HPLC检测结果均优于303nm。

    (2)50nm条件下HPLC方法的验证  根据HPLC测定结果,在250nm条件下,50、200、800μg/ml的1连续测定5次的RSD分别为0.13%、0.39%、0.40%;800μg/ml测定时,理论塔板数为14014;200和500μg/ml的加样回收率分别为101.41%、101.33%,RSD分别为0.58%和1.28%;800μg/ml的1样品, 4℃避光保存条件下16h稳定,其测定RSD为0.53%。

    3  讨论

    本文以纳他霉素为实际例子,提出了HPLC分析时波长选择及HPLC测定与分光光度测定值关系的新观点,并给出了利用分光光度检测确定波长的方法。分光光度计测定可以指导HPLC测定,HPLC检测波长的选择应该根据全波长扫描时的线性关系分析,而不是简单地选择最大吸收波长。

    选择250nm作为1的检测波长,目的是降低1的摩尔吸收系数。HPLC测定的优势是被检物质能与其它干扰物质有效分离,吸收峰与化合物之间对应关系良好,提高HPLC方法适用范围的有效手段即是改善峰面积与物质浓度之间的对应关系。对于紫外吸收较弱的物质,可以通过加大进样量等方法提高检测灵敏度;对于紫外吸收较强的物质,可以通过选择合适波长等方法来扩大线性范围。5~2000μg/ml的线性范围显然更适合1的发酵及纯化过程控制检测。

    本文通过样品的分光光度计检测来指导HPLC检测波长的选择,两者可以通过HPLC检测时峰高互相联系,即前者的目的是确定HPLC测定时峰高的最大值和最适范围。由于HPLC测定时对样品的稀释效果,HPLC的线性范围要远大于分光光度计检测的线性范围,其倍数约等于HPLC测定时样品稀释倍数的0.5倍。因此,降低HPLC进样量也可以提高HPLC检测范围。在本文中进样量为10μl,而USP26中的进样量为20μl,这也是提高1 HPLC检测线性范围的重要措施。

【参考文献】
  [1] Pedersen J C. Natamycin as a fungicide in agar media [J]. Appl Environ Microbiol,1992,58(3):1064~1066.

[2] 骆健美,金志华,岑沛霖. RPHPLC法测定发酵液中纳他霉素含量[J]. 中国抗生素杂志,2004,29(11):653~656.

[3] CapitánVallvey L F, ChecaMoreno R, Navas N. Rapid ultraviolet spectrophotometric and liquid chromatographic methods for the determination of Natamycin in lacto serum matrix [J]. J AOAC Int,2000,83(4):802~806.

[4] 袁亦丞. 纳他霉素[J]. 中国食品用化学品,1997,1(3):37~41.

[5] The United State Pharmaceutical Committee Natamycin [C]. US Pharmacopoeia 29Ntional Formulation 24,The United States Pharmacopoeia Convention, Inc.,2006,1490

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