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氧化低密度脂蛋白在慢性梗阻性黄疸大鼠肝脏中的表达与意义

首席医学网      2012年05月04日 15:38:36 Friday  
 
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作者:余水平 李坚 关晓东 王晓鸿 李培平 张百萌     作者单位:519000 珠海,中山大学附属第五医院普外三科

【摘要】  目的 探讨氧化低密度脂蛋白在慢性梗阻性黄疸大鼠中的表达与肝脏纤维化的关系?方法 60只SD大鼠被随机分成对照组(A组)和慢性梗阻性黄疸组(B组)两组,每组每时段6只?分别于造模后第1?2?3?4?5周抽取大鼠静脉血检查肝功能,显微镜目镜刻度下测量大鼠胆总管直径,免疫荧光法检测氧化低密度脂蛋白在肝脏的表达,放射免疫法检测肝纤维化三项,光学显微镜观察肝组织的病理改变?第4周行胆总管十二指肠吻合再通?结果 慢性梗阻性黄疸组大鼠术后总胆红素升高,胆总管直径扩张,组织病理学检查显示肝细胞变性,并有纤维增生性改变?与对照组比较,慢性梗阻性黄疸组肝组织氧化低密度脂蛋白的表达增强,肝纤维化三项术后第3周起明显升高?胆总管与十二指肠端侧吻合再通后黄疸缓慢消退?术后第3周氧化低密度脂蛋白的表达及肝纤维化三项差异有统计学意义(P < 0.05)?结论 慢性梗阻性黄疸大鼠肝组织氧化低密度脂蛋白的表达增强,与肝脏的纤维化的程度相关?

【关键词】  大鼠; 梗阻性黄疸; 氧化低密度脂蛋白; 肝纤维化

  【Abstract】 Objective To study the relation between expression of Ox-LDL and liver fibrosis in chronic obstructive jaundice rats model. Methods Sixty Sprague-Dawley rats were randomly and equally divided into control and chronic obstructive jaundice group. Each group was further divided into five subgroups for testing at different time points. Liver function was determined and the diameter of the common bile duct was measured under a microscope. Expression of Ox-LDL was tested by immunofluorescence and three item liver fibrosis was also measured by radioimmunodetection.Pathological changes in liver tissue were also observed by optical microscopy at weeks 1, 2, 3, 4, and 5 after model induction. Choledochoduodenostomy was performed at 4th week. Results Jaundice was mild in rats with chronic obstructive jaundice, Meanwhile the diameter of the common bile duct increased, and obvious degeneration and hyperplasia of liver cells were noted. There were also undulatory in expression of Ox-LDL and three item liver fibrosis. Jaundice slowly subsided after choledochoduodenostomy. Total bilirubin, the diameter of the common bile duct, expression of Ox-LDL and three item liver fibrosis differed significantly at different time points between rats with control group and chronic obstructive jaundice group (both P < 0.05). Conclusions There are significantly relation between expression of Ox-LDL and hepatocellular injury, particularly with fibrosis in chronic obstructive jaundice rats model. Further studies are needed to evaluate the potential effects of ox-LDL.

  【Key words】 Rat; Obstructive jaundice; Ox-LDL; Liver fibrosis syndrome

  慢性梗阻性黄疸是普外科常见的临床症状群,可引起诸多组织?器官的损害, 严重危害机体健康甚至生命,近年来对梗阻性黄疸的研究较多[1-3], 多以胆总管结扎离断导致梗阻性黄疸,与多数临床梗阻性黄疸的慢性表现不相符[4]?氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)通常被认为是致动脉粥样硬化的关键作用物,近年来研究发现肝脏的内皮细胞中存在Ox-LDL特定的受体,在梗阻性黄疸和肝脏的纤维化中发挥重要的作用[5-6]?本研究旨在慢性梗阻性黄疸大鼠模型的基础上,探讨Ox-LDL在梗阻性黄疸中的表达及在肝脏纤维化中的意义?

  材料与方法

  一?动物及分组

  雌性SD大鼠60只,体重(180 ± 20)g,随机被分对照组(A组)和慢性梗阻性黄疸模型组(B组)两组,每组30只,平均分5个时段,每时段6只?大鼠均由中山大学北校区实验动物中心提供?

  二?方法

  1.慢性大鼠梗阻性黄疸模型的建立:6-0 VICRYL可吸收线经碘仿纱布术前处理备用,实验大鼠术前12 h禁食?禁水?乙醚吸入麻醉?剑突下正中切口进腹,SXP-1C显微镜下显露胆总管,距十二指肠上缘1 cm处纵行缝过胆总管,将碘仿纱布处理的6-0 VICRYL可吸收线贯通置于胆总管内,长度0.5 cm,固定?随后关腹,结束手术?

  胆总管十二指肠端侧吻合:模型建立后第4周?术前12 h禁食?禁水?乙醚吸入麻醉?剑突下正中切口进腹,显露胆总管及十二指肠降部,SXP-1C显微镜下用8-0 PROLENE线将胆总管与十二指肠降部端侧吻合?随后关腹结束手术?对照组仅行开?关腹手术?

  2. 标本采集:分别于造模后第1?2?3?4?5周乙醚麻醉下处理各组大鼠,心脏采血行肝功能及肝纤维化三项检查?SXP-1C显微镜下刻度目镜检测胆总管直径?肝脏冰冻组织切片行氧化低密度脂蛋白检测?取出部分肝脏左叶组织行光镜检查?

  3. 免疫荧光检测肝组织氧化低密度脂蛋白:Ox-LDL抗体购自广州英韦创津试剂公司?冰冻切片冷丙酮固定10 min,滴加0.01 mol/L,pH 7.4的PBS于未知抗原标本片,10 min后弃去,使标本片保持一定湿度?用含0.05%血清的PBS封闭60 min?滴加以0.01 mol/L,pH 7.4的PBS 1∶100稀释的一抗,覆盖未知抗原标本片?将玻片置于有盖搪瓷盒内,4℃过夜?取出玻片,置于玻片架上,先用0.01 mol/L,pH 7.4的PBS冲洗1 ~ 2次,然后按顺序过0.01 mol/L,pH 7.4的PBS三缸浸泡,每缸5 min,不时振荡?取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴一定稀释度的荧光标记二抗?将玻片平放在有盖搪瓷盒内,37℃保温30 min?0.01 mol/L,pH 7.4的PBS冲洗1 ~ 2次,然后按顺序过0.01 mol/L,pH 7.4的PBS三缸浸泡,每缸5 min,不时振荡?用滤纸吸去多余水分,滴加一滴DAPI,再覆以盖玻片?荧光显微镜高倍视野下观察,结果判定同直接法?

  三?统计学处理

  数据采用SPSS 13.0 统计软件处理?计量资料以x ± s表示?两组间均数的比较采用t检验?P < 0.05被视为差异有统计学意义?

  结 果

  一?肉眼观察改变

  慢性梗阻性黄疸大鼠术后精神萎靡,活动及纳食减少,术后第3天出现尿液及尾巴黄染,1周后尿液黄染消失,至第2周尿液再次出现黄染,呈波动性,且黄染逐渐加深?标本采集时发现肝脏黄染肿胀,部分质地变硬?第4周胆总管十二指肠吻合再通后尿液黄染逐渐消失?

  二?肝功能的检查

  慢性梗阻性黄疸大鼠谷氨酸转氨酶(glutamate transaminase,AST)?总胆红素(total bilirubin,TB)?直接胆红素(direct bilirubin,DB)呈波动性增高?与对照组比较,慢性梗阻性黄疸大鼠除第2周组外,其余各组AST?TB?DB明显升高, 差异均有统计学意义(P < 0.05)?肝功能检查结果见表1?

  三?胆总管直径检测

  慢性梗阻性黄疸大鼠术后胆总管呈波动性扩张,最大直径0.5 cm?慢性梗阻性黄疸组大鼠胆总管扩张,除第2周组,其余时段各组与与对照组比较,差异均有统计学意义(P < 0.05)?胆总管直径的检测结果见表2?

  四?肝脏氧化低密度脂蛋白表达

  慢性梗阻性黄疸大鼠肝细胞胞膜及胞质中可见氧化低密度脂蛋白的荧光颗粒表达,随着梗阻时间的延长,表达强度呈现波动性增强?对照组中未见明显的氧化低密度脂蛋白荧光颗粒表达?

  结果判定:通过荧光显微镜下观察肝组织的荧光阳性比率与强度进行评分?(1)阳性细胞比率评分为:阳性细胞数占总细胞数 < 10%为0分;阳性细胞数占总细胞数11% ~ 25%为1分;阳性细胞数占总细胞数26% ~ 50%为2分;阳性细胞数占总细胞数51% ~ 75%为3分;阳性细胞数占总细胞数 > 75%为4分?(2)强度评分为: (-)为0分;(±)高倍镜下隐约可见为1分;(+)低倍镜下隐约可见为2分;(++)为高倍镜下清晰可见为3分;(+++)为低倍镜下清晰可见为4分;(++++)为低倍镜耀眼,高倍镜下刺眼为5分?(3)总评分 = 阳性细胞比率评分 + 强度评分?肝脏氧化低密度脂蛋白免疫荧光表达见图1及表3?

  五?血清肝纤维化三项检测结果

  放射免疫法检测大鼠血清透明质酸(hyaluronic acid,HA)?层黏蛋白(laminin,LN)和Ⅲ型前胶原(procollagen Ⅲ,PCⅢ)?慢性梗阻性黄疸大鼠术后第3周明显升高,与对照组相比差异均有统计学意义(P < 0.05)?血清肝纤维化三项检测结果见表4?

  六?肝组织的光学显微镜检查

  慢性梗阻性黄疸大鼠术后1周肝细胞出现水样变性,随后可见恢复,第3周后肝细胞可见点状坏死,肝小叶中央出现淤胆,小胆管增生明显,汇管区纤维化明显,肝组织部分出现纤维增生?第5 周胆总管再通后仍见肝组织部分纤维化?

  讨 论

  壶腹部良?恶性肿瘤及胆总管慢性炎症?胆总管结石等疾病多表现为波动性黄疸, 甚至可自行完全缓解[4],但胆总管结扎离断造成的黄疸模型多为急性进行性黄疸, 难以模拟许多慢性梗阻性黄疸的病理过程[7-8]?我们前期的研究发现慢性大鼠梗阻性模型黄疸症状及肝功能改变现与以往胆总管结扎断离所致的黄疸明显不同,呈现慢性?波动性发展的特征表现,更加接近于临床梗阻性黄疸病例表现[9]?梗阻性黄疸是临床常见的病理状态,可导致多系统?多器官的损害,其中最主要的是肝脏的损伤,常表现为肝脏的纤维化?肝脏纤维化是一缓慢而复杂的过程,其发生与发展是一个多因素相互作用?相互制约的结果?已有研究发现肝脏血流动力学的改变,肝细胞的凋亡,肝肠循环紊乱,肝细胞生长因子的减少和胆汁转运因子障碍等和肝纤维化密切相关?研究发现梗阻性黄疸改变了机体氧化应激的平衡状态,能加剧肝脏纤维化的发展[10-12]?脂质?蛋白是机体发生氧化应激的主要作用底物,而Ox-LDL又是脂质氧化应激的产物,能诱导内皮细胞的功能紊乱和平滑肌细胞的增生,Ox-LDL曾被认为是动脉粥样硬化的重要危险因素[13],近年来研究发现Ox-LDL能促进胶原纤维的降解,使细胞外基质发生紊乱,而肝脏的内皮细胞?巨噬细胞和枯否细胞中也存在Ox-LDL特定的受体,Ox-LDL可能促进肝脏纤维化甚至诱导肝硬化[14]?

  我们的黄疸模型模仿临床常见梗阻性黄疸,呈现慢性?波动性的过程,发现肝脏Ox-LDL的表达与肝脏的纤维化之间存在相关关系,造模后3周 Ox-LDL在肝脏的表达明显增强,差异有统计学意义(P < 0.01),随着时间的延长及梗阻恢复再通,差异仍有统计学意义?慢性梗阻性黄疸模型组肝纤维化三项与对照组相比也均有统计学意义,表明慢性梗阻性黄疸模型自造模3周后,Ox-LDL的表达与肝脏纤维化的发生并逐渐加重存在一定的联系,这与既往研究梗阻性黄疸肝脏发生纤维化的时间相同[15]?其中,第2周肝功能未出现异常,我们分析可能与第2周时胆总管的炎症引起的梗阻消退,而碘仿的物理刺激暂时未能引起胆总管梗阻有关?第4周胆道再通后肝脏的纤维化没有发生逆转,可能和我们实验时间短?慢性梗阻性黄疸病理发展慢有关,延长实验时间肝脏纤维化可能会发生逆转?

  肝脏纤维化是梗阻性黄疸的常见表现,也是肝硬化的必经阶段,其发病机制仍然未确定,及早明确肝纤维化的发病机制能有效逆转肝纤维化的发展?本研究发现Ox-LDL在肝脏的表达和肝脏的纤维化存在一定的联系,为临床提供一个新的防治慢性梗阻性黄疸引发的肝脏纤维化途径?但其作用机制未明,可能与Ox-LDL诱导肝内皮细胞的氧化应激,引起活性氧分子过度生成?肝内皮细胞功能紊乱和平滑肌细胞增生等相关,尚有待进一步研究?

  (本文图1见光盘)

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  (本文编辑:孙玉玲)

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