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丙泊酚对老年患者外周血淋巴细胞β1肾上腺素能受体脱敏的影响

首席医学网      2011年02月10日 11:58:18 Thursday  
 
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作者:吴晓智,陈国忠,吴坛光,刘 韧    作者单位:(南京军区福州总医院麻醉科,福建 福州 350025)

【摘要】  目的 观察丙泊酚单次静脉给药对老年患者外周血淋巴细胞β1肾上腺素能受体脱敏的影响,探讨丙泊酚循环抑制机制。方法 选择拟全麻下行择期手术治疗的老年患者30例,随机分为3组(n=10)。低剂量组(L组):丙泊酚1.0 mg/kg,高剂量组(H组):丙泊酚2.0 mg/kg,对照组(C组):生理盐水。全麻诱导前,静脉单次注药。给药前后3 min,记录SBP、DBP和HR变化,同时抽取外周静脉抗凝血各15 mL,Boyum法分离淋巴细胞,免疫印迹法分别检测总蛋白、胞膜和胞浆蛋白中的β1肾上腺素能受体表达,放免法检测异丙肾上腺素刺激的淋巴细胞内cAMP含量。结果 与C组比较,L组和H组给药后均可引起SBP、DBP、淋巴细胞内cAMP含量及胞膜β1肾上腺素能受体蛋白水平降低(P<0.05或P<0.01),胞浆β1肾上腺素能受体蛋白水平增加(P<0.05或P<0.01);与L组比较,H组的指标变化明显(P<0.05)。组间两两比较,淋巴细胞总蛋白中β1肾上腺素能受体水平变化均无显著差别(P>0.05)。结论 丙泊酚单次静脉给药可引起老年患者外周血淋巴细胞β1肾上腺素能受体脱敏,且呈剂量依赖性,与促进β1肾上腺素能受体由胞膜内化进入胞浆有关;β1肾上腺素能受体脱敏可能是丙泊酚的循环抑制机制之一。

【关键词】  丙泊酚;外周血淋巴细胞;β1肾上腺素能受体;脱敏;免疫印迹

 Abstract: Objective To evaluate the effect of propofol on the desensitization of peripheral lymphocytic β1 adrenergic receptor (β1AR) in eldly patients. Methods Thirty eldly patients were recruited and classified into three groups (n=10): low dose group (group L), high dose group (group H) and control group (group C). 1.0 mg/kg propofol was given to group L, 2.0 mg/kg propofol was given to group H and normal saline was given to group C through intravenous injection. The systolic blood pressure (SBP), diastolic blood pressure (DBP) and heart rate (HR) before and after injection were recorded. The lymphocytes were isolated. The expressions of β1AR in total protein, cytomembrane and cytoplasm were detected by western blot respectively. Isoproterenolstimulated cAMP products in lymphocytes were measured by radioimmunoassay. Results SBP,DBP,cAMP product and β1AR level in lymphocytic cytomembrane in group L and group H were lower than those in group C (P<0.05). On the contrary, β1AR protein level in lymphocytic cytoplasm in group L and group H was significantly higher than that in group C (P<0.05). No significant differences in β1AR level in total protein was detected between the three groups(P>0.05). Conclusion Intravenous injection of propofol to elderly patients can induce the desensitization of peripheral lymphocytic β1AR in a dosedependent manner. β1adrenergic signal transduction in peripheral lymphocyte was decreased through internalizing β1AR into cytoplasm and inhibiting cAMP production, which could be a contributory factor of cardiac vascular inhibition.

  Keywords: propofol;peripheral lymphocyte; β1 adrenergic receptor; desensitization; western blot

  丙泊酚对老年患者的心血管抑制效应明显,其机制目前尚不明确。研究表明,β肾上腺素能受体(βAR)脱敏可引起心肌兴奋收缩脱偶联,降低心肌收缩力。人类外周血淋巴细胞和心肌细胞βAR反应性相平行[1]。本研究通过观察丙泊酚对老年患者外周血淋巴细胞β1肾上腺素能受体(β1AR)脱敏的影响,探讨其循环抑制机制。

  1 资料与方法

  1.1 临床资料

  选择拟全麻下行择期手术治疗的老年患者30例,年龄65~78岁(平均70.2岁),ASAⅠ~Ⅱ级,随机分为3组(n=10),每组男、女各5例。低剂量组(L组):丙泊酚1.0 mg/kg。高剂量组(H组):丙泊酚2.0 mg/kg。对照组(C组):生理盐水0.25 mL/kg。排除合并心血管系统疾病、糖尿病及甲状腺功能异常患者。

  1.2 主要试剂及仪器

  丙泊酚(AstraZeneca S.P.A.);人淋巴细胞分离液、3异丁基1甲基黄嘌呤(Sigma公司);异丙肾上腺素注射液;125IcAMP放免试剂盒(上海中医药大学核医学实验室);胞核胞浆胞膜制备试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);RIPA细胞裂解液(强)(上海碧云天生物技术有限公司);兔抗人β1AR多克隆抗体、小鼠抗人βactin单克隆抗体及HRP标记的羊抗兔(鼠)IgG(美国Santa Cruz公司);ECM显色剂(武汉博士德生物工程有限公司)。SN697型γ计数仪;垂直凝胶电泳系统及湿转仪(BIORAD公司);PVDF膜(Millipore公司)。

  1.3 外周血淋巴细胞分离

  入室后开放静脉,监测BP、ECG、SpO2,面罩供氧,循环稳定后注射丙泊酚或生理盐水,丙泊酚输药速度每10 s大约3 mL(30 mg)。给药前后3 min,各抽取静脉肝素抗凝血15 mL,Boyum法分离淋巴细胞(参照人淋巴细胞分离液使用说明)。1×PBS液调整细胞浓度为5×106 /mL,经Gimsa Wright和Trypan blue染色鉴定,淋巴细胞纯度大于90%,活力大于98%。本过程均于采血后1 h内完成。

  1.4 放免法测定淋巴细胞cAMP含量

  取淋巴细胞悬液500 μl,加入1 mmol/L异丙肾上腺素10 μl,用结合缓冲液(1 mmol/L 3异丁基1甲基黄嘌呤)将反应体系调至600 μl,孵育12 min(37 ℃),煮沸5 min终止反应,离心(800 g×15 min),取上清液100 μl,放免法测定各样本的cAMP含量(参照125IcAMP放免试剂盒使用说明)。

  1.5 Western blot法测定β1AR蛋白表达

  每个淋巴细胞悬液样品取0.5 mL及2.0 mL各一份,离心(800 g ×5 min),弃上清,采用RIPA(强)裂解液(含1 mmol/L PMSF)制备总蛋白,胞核胞浆胞膜制备试剂盒差速离心法制备胞膜粗成份及胞浆蛋白(具体操作参照产品说明书)。所得胞膜粗成份加入适量RIPA裂解液,继续提取胞膜蛋白。BCA法测定蛋白含量。取蛋白样品各50 μg,按体积比4∶1加入5×SDS蛋白上样缓冲液(含DTT),100 ℃煮沸5 min,冷却至室温后和预染的低分子量蛋白质Marker分别上样。经12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶70 V,分离胶120 V),恒压110 V×2.5 h转膜,丽春红染色后进行免疫检测。5%脱脂奶粉室温封闭2 h,与一抗(兔抗人β1AR多克隆抗体,1∶300;鼠抗人βactin单克隆抗体,1∶3 000)孵育过夜,二抗(HRP标记的羊抗兔IgG,1∶3 000;HRP标记的羊抗小鼠IgG,1∶5 000)室温孵育50 min,经含0.05% Tween20的Tris碱缓冲液洗膜(3×10 min)后,ECL显色3 min,暗室中压片2 min,显影、定影各1 min。FluorS图像分析系统对区带进行扫描,含量以平均吸光度A乘以面积表示。产物半定量以β1AR和βactin间的比值计算。

  1.6 统计学处理

  数据采用SPSS 11.5统计软件分析处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组内比较用配对t检验,组间比较用单因素方差分析SNKq检验。P<0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 外周血淋巴细胞cAMP含量变化

  丙泊酚对外周血淋巴细胞内cAMP含量的影响见表1。与C比较,L组和H组给药后异丙肾上腺素刺激的淋巴细胞内cAMP含量均不同程度降低(P<0.05或P<0.01)。与L组比较,H组cAMP降低幅度明显(P<0.05)。表1 淋巴细胞内cAMP含量变化

  2.2 丙泊酚对老年患者血流动力学的影响

  与C比较,L组和H组给药后SBP、DBP均显著降低(P<0.05或P<0.01),HR轻度降低但差别无统计学意义(P>0.05)。与L组比较,H组SBP、DBP降低幅度明显(P<0.05),见表2。表2 不同剂量丙泊酚对血流动力学的影响比较

  2.3 外周血淋巴细胞β1AR蛋白水平的变化

  Western blot法分别检测老年患者外周血淋巴细胞β1AR蛋白和内参βactin蛋白表达,结果显示65 kDa和43 kDa的特异信号产物(图1)。外周血淋巴细胞胞膜、胞浆和总蛋白中β1AR蛋白水平变化见图2。与C组比较,L组和H组给药后淋巴细胞胞膜的β1AR蛋白水平均不同程度降低(P<0.05),胞浆的β1AR蛋白水平均不同程度增加(P<0.05);与L组比较,H组的变化幅度明显(P<0.05);组间两两比较,淋巴细胞总蛋白中β1AR蛋白水平变化均无显著差别(P>0.05)。C:对照组;L:低剂量组;H:高剂量组;mp:膜蛋白;cp:胞浆蛋白;tp:总蛋白图1 Western blot法检测外周血淋巴细胞β1AR蛋白表达*:与C组比较,P<0.05;#:与C组比较,P<0.01;▲:与L组比较,P<0.05;mp:膜蛋白;cp:胞浆蛋白;tp:总蛋白图2 丙泊酚对外周血淋巴细胞β1AR水平的影响

  3 讨论

  丙泊酚是临床麻醉中常用的静脉麻醉药,用于成人全麻诱导推荐剂量为1.5~2.5 mg/kg,老年患者所需用药量一般有所下降。丙泊酚在组织内分布半衰期为2~4 min。故本研究采用1.0 mg/kg和2.0 mg/kg两种剂量,并于输药前后3 min检测相关指标。本研究结果表明,所用两种剂量丙泊酚单次静脉注射,均可引起老年患者循环抑制,异丙肾上腺素刺激的外周血淋巴细胞内cAMP产量降低,淋巴细胞胞膜β1AR蛋白水平降低和胞浆β1AR蛋白水平增加;高剂量组上述指标变化更为明显。所用两种剂量均不影响淋巴细胞总蛋白中β1AR水平。

  β1AR下调或与G蛋白的结合受阻均可降低受体对儿茶酚胺的敏感性,减少细胞内cAMP产量,出现脱敏现象[2]。动物研究表明,异丙酚静脉给药可引起大鼠心肌βAR下调,其程度与剂量有关[3]。本研究结果与上述报道相似,且进一步证实临床剂量的丙泊酚单次给药,导致外周血淋巴细胞β1AR下调,主要与改变受体在胞膜和胞浆中的分布有关,而不影响β1AR蛋白总体表达水平。丙泊酚是否影响β1AR与G蛋白的结合有待进一步研究。丙泊酚下调β1AR的机制尚不明确,可能与抑制中枢及外周的交感神经活性有关。有文献报道,丙泊酚可降低交感神经系统神经肽Y及去甲肾上腺素分泌[4]。β1AR下调所导致的心血管系统的低反应性,部分解释了丙泊酚降低血压但却不伴随反射性心率增快,甚至轻度减慢心率的原因。细胞内cAMP含量依赖于儿茶酚胺与β1AR结合激活Gαs,从而活化AC。β1AR脱敏,ACcAMPPKC信号转导通路受阻,影响L型钙通道磷酸化程度及钙离子内流[5],可能是丙泊酚抑制心肌收缩力的重要作用机制。

  目前多数研究采用放射配基受体结合分析法测定心肌细胞表面βAR密度。放射性物质需要特殊防护措施且具有潜在的放射污染,实验应用受到一定限制。心肌标本取材困难,临床研究同样受到限制。与心肌细胞相似,淋巴细胞表面同样存在β1、β2和β3三种βAR亚型分布[6]。本研究采用密度梯度离心法分离淋巴细胞组份,Western blot法分别检测β1AR表达,结果表明丙泊酚对淋巴细胞胞膜中β1AR分布及胞浆中cAMP产量变化与给药剂量有关,与SBP、DBP变化趋势相同,提示外周血淋巴细胞可作为有效模型,间接反应麻醉药物对心肌β1AR系统的影响。

  总之,本研究表明,丙泊酚单次静脉给药可引起老年患者外周血淋巴细胞β1AR脱敏,呈剂量依赖性,与促进β1AR由胞膜内化进入胞浆有关,但不改变β1AR蛋白表达水平。

 

【参考文献】
   [1] Tilley DG, Rockman HA. Role of betaadrenergic receptor signaling and desensitization in heart failure: new concepts and prospects for treatment[J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2006,4(3):417-432.

  [2] 冯作化.医学分子生物学[M].北京:人民卫生出版社,2005.131-133.

  [3] 黄雄庆,陈秉学,卢汉平,等.异丙酚对大鼠心肌β受体的影响[J].中华麻醉学杂志,1998,18(12):741-743.

  [4] Uchida M, Iida H, Osawa Y, et al. Clonidine attenuates the hemodynamic responses to hypercapnia during propofol anesthesia [J]. Can J Anaesth, 2004,51(2):188-189.

  [5] Wickley PJ, Shiga T, Murray PA, et al. Propofol decreases myofilament Ca2+ sensitivity via a protein kinase C, nitric oxide synthasedependent pathway in diabetic cardiomyocytes[J]. Anesthesiology, 2006,104(5):978-987.

  [6] Yu XY, Lin SG, Wang XM, et al. Evidence for coexistence of three betaadrenoceptor subtypes in human peripheral lymphocytes[J]. Clin Pharmacol Ther, 2007,81(5):654-658.

  (编辑:余汇洋)

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