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趋化因子受体CXCR4在骨髓间充质干细胞中的表达

首席医学网      2011年02月10日 11:48:04 Thursday  
 
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作者:朱志立1,米 娜2,李 靖2,郑 璐2,黄小兵2    作者单位:(第三军医大学:1.基础医学部外科应用解剖与手术学教研室,重庆 400038;2.新桥医院肝胆外科,重庆 400037)

【摘要】  目的 体外研究趋化因子受体CXCR4在骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法 体外培养大鼠骨髓基质细胞,构建CXCR4腺病毒表达载体,采用Western blotting对骨髓基质细胞的CXCR4受体表达水平进行检测。结果 骨髓间充质干细胞能高表达CXCR4蛋白。结论 CXCR4蛋白在骨髓间充质干细胞高表达,为进一步研究SDF1/CXCR4轴介导BMSCs在肝脏选择性归巢打下基础。

【关键词】  骨髓间充质干细胞;趋化因子受体CXCR4;归巢

 Abstract: Objective To study the expression of CXC chemokine receptor4(CXCR4) in bone mesenchymal stem cells. MethodsBone mesenchymal stromal stem cells (BMSCs) of rats were cultured in vitro, adenovirus vecto of CXCR4 was constructed and the expression level of CXCR4 receptor of BMSCs was tested by western blot. Results BMSCs can express CXCR4 and the positive ratio was high. Conclusion The high ratio of expression laid foundations for the further study in the effect of stromal cellderived factor1/ CXCR4 (SDF1/CXCR4) axis on bone mesenchymal stem cell homing to liver.

  Keywords: bone mesenchymal stem cells (BMSCs); CXC chemokine receptor 4 (CXCR4); homing

  骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞,具有分化成各种间叶组织细胞的潜能。利用其在活体内外均可分化为有功能的肝细胞的潜能,用于肝硬化、肝纤维化等的治疗具有重要的临床价值[1],而增加干细胞在肝脏的选择性归巢对治疗效果具有重要的意义。目前研究发现干细胞趋化因子1(SDF1)及其受体CXCR4对干细胞动员、迁移、细胞归巢起到重要作用。CXCR4广泛表达在包括单核细胞、淋巴细胞及所有CD34+细胞表面,与SDF1构成SDF1/CXCR4生物轴,参与细胞间信息传递及细胞迁移,其相互作用对移植的干细胞定位到肝组织起到了关键作用[23]。本实验将通过动物实验通过构建CXCR4腺病毒载体对骨髓基质细胞中CXCR4的表达进行鉴定,为进一步研究SDF1/CXCR4轴介导BMSCs在肝脏选择性归巢打下基础。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  雄性C57BL/6J小鼠,DMEM/F12培养基(GIBCO),胎牛血清(GIBCO),胰蛋白酶(Sigma),质粒抽提试剂盒(天根),连接酶T4 Lignase(TOYOBO),Trizol总RNA提取液(天根),Rever Tre Acea逆转录试剂盒(TOYOBO),PCR System 9700(Applied Biosy Stems),酶标仪(TECAN),倒置显微镜(Olympus),荧光显微镜(Leica),凝胶成象系统(BioRad),超净工作台(Nuair)。CXCR4引物由上海生工合成,上游引物序列:5’AGATCTATGGAACCGATCAGTGTGAGTATATACACTTCTGATAACT 3’,下游引物序列:5’GTCGAC TTAGCTGGAGTGAAAACTGGAGG 3’。

  1.2 方法

  1.2.1 BMSCs的分离培养

  引颈脱臼处死小鼠,75%酒精浸泡5 min,无菌条件下取股骨、胫骨,暴露骨髓腔,DMEM/F12基础培养液冲洗骨髓腔直至发白,收集冲洗液。反复吹打收集的冲洗液,制成单细胞悬液,置水平离心机中离心。以4×105/cm2 的密度接种于DMEM/F12完全培养液(含有青霉素100 IU/mL,链霉素100 μg/mL,胎牛血清10%)的25 cm2培养瓶中,置于5%CO2、饱和湿度、37 ℃细胞培养箱中培养。48~72 h后全量换液,去除未贴壁细胞,以后每3 d换液。倒置显微镜下逐日观察细胞形态及生长情况。当细胞铺满皿底达80%~90%融合(原代7~10 d,传代后5~7 d),倾弃旧培养液,PBS洗涤2次,加入0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA(1∶1体积比)于37 ℃孵育3~5 min。待细胞消化充分时,以血清终止胰蛋白酶作用。吸管吹打后收集细胞悬液离心。用10%FBS的DMEM/F12完全培养基(10%FBSDMEM/F12)重悬,调整细胞密度至1×103/cm2接种25 cm2培养瓶中,按1∶2比例进行传代培养代培养。免疫组织化学方法对BMSCs进行鉴定。

  1.2.2 CXCR4基因克隆与腺病毒包装

  采用Trizol试剂提取肝脏组织中总RNA,进行RNA质量检测(图1),制备cDNA,PCR扩增目的条带(图2),参照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行胶回收,目的条带连接PTA2(T载体)。将连接产物进行转化培养,参照质粒抽提试剂盒说明书收集菌液沉淀抽提质粒,进行双酶切鉴定(图3)。质粒抽提后双酶切鉴定正确后送上海生工测序。测序结果:扩增序列与GENEBANK中做发表的序列完全一致。目的条带连接腺病毒穿梭载体PadTrack。连接产物转化,提质粒。pme I线性化后转化至BJ5183同源重组菌中。挑取重组子,Pac I酶切鉴定正确后进行病毒包装(图4)。病毒至第五代并大量扩增病毒(图5)。1、2:均为所提RNA图1 RNA质量检测M:markerD2000,从上至小分别代表的条带大小分别是2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp;1:PCR扩增片段图2 PCR扩增条带电泳M:markerD2000;1、2、3:载体自连;4:正确的阳性克隆图3 双切酶鉴定M:从上至小代表的大小分别是15 000 bp、10 000 bp、7 500 bp、5 000 bp、2 500 bp、1 000 bp、500bp;1、2:重组载体  图4 重组载体电泳图5 腺病毒荧光照片

  1.2.3 鉴定间充质干细胞对CXCR4的表达

  CXCR4转染间充质干细胞,取第三代BMSCs,病毒原液用PBS稀释10倍,均匀转染细胞,制成单细胞悬液。采用Western Blotting鉴定间充质干细胞的CXCR4表达水平,分析结果。

  2 结果

  2.1 BMSCs分离及传代培养的观察结果

  采用贴壁法成功地分离培养出了BMSCs。原代培养骨髓基质细胞约24~48 h贴壁,贴壁细胞初呈不规则近圆形。4 d后细胞迅速增殖, 出现细胞集落。原代培养约7~10 d达到80%~85%细胞融合,呈漩涡状生长。传代细胞12~24 h贴壁,以梭形细胞为主。5~7 d细胞达80%融合。种植后4~24 h贴壁,5 d有80%~90%以上的融和,形态为成纤维样和梭形细胞为主。细胞排列成漩涡状或放射样分布。免疫组织化学方法对BMSCs进行鉴定,显示CD34、CD45表达阴性,CD44、CD54表达阳性。

  2.2 CXCR4的表达

  采用Western Blotting鉴定间充质干细胞的CXCR4表达水平,实验结果显示:间充质干细胞能高表达CXCR4蛋白(图6)。

  3 讨论

  本实验成功地构建了CXCR4腺病毒载体并对BMSCs中CXCR4的表达进行鉴定,结果说明表达是成功的。有研究用Western blotting分析,数据表明有CXCR4受体表达,但可能是以糖基化形式存在[4]。有研究发现BMSCs表达CXCR4也是随着传代数增加而减少,可能和细胞活性降低有关,提示临床应用骨髓基质干细胞治疗应选用近代细胞为佳[5]。1:CXCR4;2:阴性对照图6 间充质干细胞的CXCR4表达

  临床研究发现BMSCs对肝脏的修复至少应包括两方面的作用,即对受损肝脏功能的恢复以及促进受损肝脏的再生。Fürst[6]证实自体BMSCs移植可促进受损肝脏再生。临床上也有报道BMSCs移植可促进受损肝脏的功能恢复[7]。SDF1的受体CXCR4是一个G蛋白偶联受体,SDF1/CXCR4轴在BMSCs归巢中有重要作用,是干细胞迁移的关键因素,因此SDF1/CXCR4对干细胞的增殖和迁移的重要性越来越受到重视[8]。如能提高CXCR4在骨髓基质干细胞中的表达,将为干细胞移植治疗肝硬化肝纤维化的临床应用提供广阔的前景。

【参考文献】
    [1] Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J]. Nature, 2002, 418(6893):41-49.

  [2] Jung YJ, Ryu KH, Cho SJ, et al. Syngenic bone marrow cells restore hepatic function in carbon tetrachlorideinduced mouse liver injury[J]. Stem Cells Dev, 2006,15(5):687-695.

  [3] 金晓蕾,孙文夏,施育平,等.脂代谢相关三基因突变小鼠肝组织基因表达差异研究[ J].中华医学遗传学杂志, 2005, 22(1): 27-30.

  [4] Wynn RF, Hart CA, CorradiPerini C, et al. A small proportion of mesenchymal stem cells strongly expresses functionally active CXCR4 receptor capable of promoting migration to bone marrow[J]. Blood, 2004, 104(9): 2643-2645.

  [5] 曹 阳,吕 刚,于 洋,等.趋化因子受体CXCR4在骨髓基质细胞中的表达及分析[J].辽宁医学院学报,2009,30(2):105-106,115.

  [6] Fürst G, Schulte am Esch J, Poll LW, et al. Portal vein embolization and autologous CD133+bone marrow stem cells for liver regeneration: initial experience[J]. Radiology, 2007,243(1):171-179.

  [7] Terai S, Ishikawa T, Omori K, et al. Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrowcell infusion therapy[J]. Stem Cells, 2006,24(10):2292-2298.

  [8] Horvat S, Bünger L. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RLFP) assayfor themouse leptin receptor (Leprdb) mutation[J]. LabAnim, 1999, 33(3): 380-384.

  (编辑:左艳芳)

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