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脊髓腹侧神经元的纯化培养与鉴定

首席医学网      2011年02月10日 11:45:07 Thursday  
 
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作者:文 灿1,3,黄 河2,王晗知1,张艳玲1,梁亚杰1,郭 强1,苏炳银1,4    作者单位:(1.第三军医大学基础医学部神经生物学教研室,重庆 400038;2.第三军医大学新桥医院麻醉科,重庆 400037;3.第三军医大学基础医学部外科应用解剖与手术学教研室,重庆 400038;4.成都医学院组织胚胎与神经生物学教研室,四川 成都 610081)

【摘要】  目的 探讨胚胎大鼠脊髓腹侧组织神经元的分离、纯化和培养方法,并予以分类鉴定和测定其纯度。方法 取胚胎大鼠脊髓腹侧组织分离成细胞悬液,经差速贴壁后在无血清条件培养基里培养,采用免疫细胞化学双标染色法对培养盖片上的细胞予以鉴定、分类,结合Hoechst荧光染核,计数各细胞成分的含量。结果 细胞贴壁生长好,神经元占87.8%,其中,运动神经元达70.9%,星形胶质细胞占7.5%,NF200和GFAP染色皆为阴性的细胞占4.7%。结论 差速贴壁接种法结合无血清条件培养基培养脊髓腹侧组织能有效抑制星形胶质细胞的快速增殖,能培养出高纯度的神经元,尤其是脊髓运动神经元。

【关键词】  神经元;胆碱乙酰转移酶;神经微丝蛋白;胶质纤维酸性蛋白

 Abstract: Objective To explore the method of isolation , culture and purification of neurons from ventral spinal cord tissues in embryonic rats in order to do classified identification and to fix purity coefficients. Methods Ventral spinal cord tissues of embryonic rats were dissected and cell suspensions were made. Cells were cultured in serum-free medium after treating by differential adhesion method and the classified identification was made by double immunocytochemistry labeling stain. In addition, the nucleuses were stained by Hoechst and the contents of the cells were counted. Results Cells adhered and grew well. Immunocytochemistry revealed that the neuronal purity was up to 87.8% with the purity of spinal motor neurons, astrocyte and negative cells stained by NF200 and GFAP being 70.9%, 7.5% and 4.7% respectively. Conclusion The rapid proliferation of astrocyte could be inhibited efficiently and neurons with high purity, especially spinal cord neurons could be got by method of differential adhesion associated with serum-free culture medium.

  Keywords: neuron; choline acetyl transferase; neurofilament; glial fibrillary acidic protein

  神经细胞原代培养对研究细胞形态、细胞功能及电生理特性和神经药物学等具有重要作用,已从组织块的培养逐渐发展到单一类型细胞的高纯度分散培养[1]。取胚胎大鼠脊髓腹侧组织做神经元原代培养的研究报道很多[24],但因其组织成分复杂,包括神经元和众多的胶质细胞,前者以运动神经元(motor neuron, MN)为主,后者以星形胶质细胞为主(astrocyte, AST),很难培养到单一类型的神经元,不同培养方法所得的细胞成分含量不同,甚至形态都可不同。因此有必要对特定培养体系所得细胞进行分类鉴定,对各类细胞的形态特征和所占比例进行研究,为相关的研究工作提供参考资料。

  1 材料与方法

  1.1 试剂与仪器

  Neurobasal培养基、B27添加剂、DHanks液和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司,多聚D赖氨酸(polyDlysine, PDL)、神经生长因子(NGF)、L谷氨酰胺、Hoechst和小鼠抗神经微丝单克隆抗体(NF200抗体)购自Sigma公司,GDNF购自Propetech公司,羊抗胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗体购自Chemicon公司,兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、FITC标记山羊抗兔IgG、TRITC标记山羊抗小鼠IgG和抗体稀释液皆购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

  1.2 培养盖片的准备

  将清洁的10 mm×10 mm盖玻片擦干、灭菌后放入24孔培养板,多聚D赖氨酸100 μg/mL(PDL,用pH为8.5的0.01 mol/L硼酸溶液稀释)包被,每盖片50 μl,超净台内RT过夜,ddH2O洗3次,晾干备用。

  1.3 细胞的分离、培养

  取孕16 d的SD大鼠(购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心),腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,行无菌操作取出妊娠子宫,灭菌ddH2O反复冲洗血污,在解剖显微镜下分离出E16 d胚胎大鼠的脊髓,仔细剔除神经根和脊膜,切取腹侧组织,剪成小块。加入2 mL 0.125%胰蛋白酶,37 ℃孵育15 min,用含10%FBS的L15培养基终止消化,冲洗2~3次,随后用火焰刨光玻璃吸管吹打组织,制成细胞悬液,过200目筛网后接种在35 mm直径培养皿中,进行差速贴壁(37 ℃培养箱中孵育30 min,以去除成纤维细胞等),吸取未贴壁悬液离心收集细胞,加入全培养液(主要配方:Neurobasal 培养基50 mL,B27 1.0 mL,NGF 500 ng,GDNF 500 ng,LGlutamine 3.7 mg),用红细胞计数板调节细胞密度到1×106/mL,接种在24孔培养板中经处理的盖玻片上,每盖片50 μl,置37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,4 h后轻缓添加全培养液至铺满孔底,每3 d半量换液1次。

  1.4 细胞鉴定

  采用免疫细胞化学技术,以Hoechst标记细胞核,以便于细胞计数,且以分散的单个胞核计数为1个细胞,成团或簇者算1个细胞;以GFAP特异性标记星形胶质细胞、NF200特异性标记神经元、ChAT(1∶1 000)特异性标记脊髓运动神经元(spinal motoneuron,SMN)。取培养4 d的细胞进行免疫组织化学染色,用NF200分别与ChAT和GFAP进行免疫荧光双标,弃培养液,PBS漂洗2次后加入4%PFA室温固定30 min,PBS漂洗5 min×4,加NF200抗体(1∶1 000)每盖片50 μl,37 ℃湿盒孵育1 h后4 ℃冰箱过夜,PBS漂洗5 min×3次,TRITC标记山羊抗小鼠IgG(1∶400)37 ℃孵育1.5 h,PBS漂洗5 min×3次,加GFAP抗体(1∶500)或ChAT抗体,以等量的抗体稀释液作为对照,37 ℃湿盒孵育4 h后PBS漂洗5 min×3次,FITC标记山羊抗兔IgG(1∶400)在37 ℃湿盒孵育1 h后Hoechst(终浓度为1 μg/mL)染细胞核5 min;漂洗封片后荧光显微镜观察、照相。

  1.5 分类细胞计数

  在显微镜下随机选取20个视野,分别计数发蓝光的细胞核数量(表示细胞总数),NF200阳性细胞数(红光)和ChAT/GFAP阳性细胞数(绿光),以及NF200与ChAT双标的细胞数,算出平均每个视野中ChAT及NF200阳性细胞所占的比例,以及GFAP阳性细胞所占比例。

  2 结果

  2.1 培养细胞的生长状况

  刚接种时细胞呈圆形,12 h后大部分细胞均已贴壁,呈单个圆形或椭圆形,胞体透亮匀质,周围有生长晕;24 h后,多数细胞长出较短的突起,细胞由圆形变为椭圆形或不规则形态,少数未贴壁的悬浮细胞死亡,成为漂浮的碎片;2 d后生长明显加快,胞体增大,突起生长旺盛,突起数目增多、伸长,并逐渐分支,突起末端可见生长锥样结构,形状多不规则;4 d后有的细胞变成三角形、多角形或不规则形,胞体大而饱满,周围有明显的光晕,立体感强,细胞表面光滑呈立体隆起,生长晕清晰,胞质均匀,细胞突起增粗增多,少数已与邻近细胞形成连接;7 d左右,神经元趋于成熟,立体感强,有明显的光晕,胞体大而丰满,胞浆透亮,神经细胞之间形成网络状联系。

  2.2 培养细胞的鉴定

  培养4 d的脊髓腹侧细胞经免疫细胞化学染色,NF200抗体染色是神经元特异性染色,阳性细胞即为神经元。本实验中采用的是异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)标记的荧光二抗,阳性细胞发红色荧光,荧光显微镜下可见神经元胞浆着色,形态多为三角形、椭圆形和不规则形,大小不一,突起显示清晰。ChAT是脊髓腹侧培养细胞中SMN的特异性标记物,在进行ChAT免疫细胞化学染色中,采用的是异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光二抗,阳性细胞发绿色荧光,阳性神经元的胞体相对较大,形态多样,并具有单个较长的轴索样突起,典型的运动神经元呈锥形,从胞体长出一个或多个未分化的短小突起,其中一个突起稍长(图1)。GFAP是星形胶质细胞的标记物,阳性细胞亦发绿色荧光,数量较少,直径相对较小,直径约10~20 μm,呈多突起的不规则形,结合Hoechst染核知其核大,呈圆形或卵圆形,常偏位(图2)。以Hoechst标记的细胞核发蓝色荧光,胞核发光均匀,提示细胞状态较好。

  a: NF200标记;b: ChAT标记;c: Hoechst染核;d: 三标重叠,NF200、ChAT标记均阴性(↑),即为非神经元细胞核;为NF200标记阳性而ChAT标记阴性(↑),是非胆碱能神经元,不是SMN 图1 培养盖片做NF200(红)、ChAT(绿)、Hoechst(蓝)三标(荧光显微镜,标尺=50 μm) a: NF200标记;b: GFAP标记,仅数个AST(↑);c: Hoechst染核;d: 三标重叠,存在少许非神经元、非AST细胞(↑)图2 培养盖片做NF200(红)、GFAP(绿)、Hoechst(蓝)三标(荧光显微镜,标尺=50 μm)

  2.3 培养细胞的计数

  计数随机视野中细胞核数量、NF200和ChAT或GFAP阳性细胞数,分别代表培养细胞总数、神经元、运动神经元或星形胶质细胞数目,计算出各自所占比例。NF200标记阳性细胞占细胞总数的87.8%,其中,与ChAT双标阳性的细胞占70.9%,即NF200标记阳性而ChAT标记阴性者(可能为中间神经元或其它类型神经元)为16.9%,GFAP标记阳性细胞占7.5%,但也有约4.7%的细胞既没标记NF200又没标记GFAP,提示为其它类型的细胞。

  3 讨论

  神经细胞离体培养是研究神经生理、神经病理、神经发育与再生以及神经营养因子的常用研究手段,但神经元作为一种高度分化的细胞,形态上有胞体、突起之分,对理化因素的影响十分敏感,相对于机体的其它细胞,在体外难以存活和生长,培养条件要求苛刻。脊髓腹侧组织原代培养很难培养到单一类型的神经元,加之神经元很脆弱,尤其是运动神经元,体积大、耐受极差,不便采用流式细胞进行淘选,故研究培养的细胞中各类神经元的形态特征和所占比例就尤为重要。

  神经元能否培养成功,以及培养神经元的纯度很大程度上与组织取材动物的年龄有关。SMN作为下运动神经元,对营养条件要求极高,对环境变化极为敏感,有关SMN培养的报道颇多[24]。哺乳动物的SMN原代分离细胞培养较为困难,通常都选取大鼠胚胎脊髓组织,一方面是因为此时的神经元分化程度较低,体外存活能力较强;另一方面是避免过度损伤SMN的轴突和树突,若在成熟时分离,会使SMN受到更为严重的损伤,导致SMN存活率极低;此外,由于大鼠神经细胞在14 d前后会发生程序性死亡,有报道认为从胚胎14 d至出生后3 d,SMN会减少一半[2]。如果胚龄偏小,神经细胞还没有分化成神经元,无法获得分化成熟的神经元,且脊髓腹侧组织的取材较为困难。若胚龄偏大,程序性死亡已经完成,所获得的神经元数量将大大减少。因此,取材选择16 d胎鼠能获得较多的SMN,此时神经元的耐受性较强,存活率高。培养7 d左右神经元趋于成熟,是进行实验研究的黄金时间。

  SMN对培养微环境、培养条件要求极为苛刻。本实验中同时加入了NGF和GDNF,二者具有很强的促神经元存活、生长作用[56],尤其是GDNF,它属转化生长因子β超家族成员,能发挥多效能的神经营养作用,是目前克隆到的最强的促运动神经元存活、生长的营养因子[7]。本实验结果提示,该培养条件能满足神经元生长需要,培养的神经元纯度可达87.8%,SMN纯度也高达70.9%,能满足常规实验研究的需要。此外,约有4.7%的细胞既没标记NF200,又没标记GFAP,可能为少突胶质细胞、成纤维细胞或小胶质细胞等。

  从脊髓腹侧组织分离得到的细胞中,胶质细胞和成纤维细胞可反复增殖,而神经元是分裂后细胞,不能增殖分裂,目前尚无彻底去除非神经元细胞的方法,只有尽可能去除非神经细胞,从而提高神经元培养的纯度。为此,学者们采取了多种方法以提高培养神经元纯度,其中,在培养早期加入阿糖胞苷(arabinoside cytosine,AraC)应用较为广泛[8]。但如AraC加入浓度过高或时间过早,就会影响神经元的存活;而加入浓度过低或时间过晚,又不能有效抑制胶质细胞增殖。总之,在不同条件下培养特定的神经元,要合理应用AraC,需要仔细摸索条件,颇为复杂。本研究采用下列措施提高神经元的纯度:首先,细胞悬液接种前进行差速贴壁。差速贴壁就是利用不同细胞在进行分离培养时,接种后贴壁速度存在显著差异,来分离细胞。先将细胞悬液接种在培养皿中,置于培养箱中孵育30 min,大多数血细胞、成纤维细胞和胶质细胞都在培养皿上贴壁;再收集未贴壁细胞进行接种,从而提高神经元纯度。其次,采用无血清条件培养液。无血清培养液能适合神经元离体生长,但不适合成纤维细胞和神经胶质细胞的生长,而且能抑制这些非神经元细胞的迁移与增殖。本研究用无血清限定性培养基Neurobasal联合B27添加物作为基础培养基,辅以细胞因子(GDNF和NGF),虽未加入AraC,仍能较好地抑制非神经元细胞的增殖,神经元纯度高,生长状态良好。此外,为了加快神经元粘附贴壁,我们首先浓缩细胞悬液,每张经处理的盖玻片仅接种50 μl细胞悬液,降低培养液的悬浮力,使得细胞只需下降很小距离就触及生长底物,减少了细胞在接种悬液内缓慢下沉逐渐贴壁的距离,约4 h后轻缓补足全培养液。

【参考文献】
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  [3] Das M, Rumsey JW, Gregory CA, et al.Embryonic motoneuronskeletal muscle coculture in a defined system[J]. Neuroscience, 2007, 146(2): 481-488.

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  [6] Larsen KE, Benn SC, Ay I, et al. A glial cell linederived neurotrophic factor (GDNF): tetanus toxin fragment C protein conjugate improves delivery of GDNF to spinal cord motor neurons in mice[J].Brain Res, 2006, 1120(1): 1-12.

  [7] Andersona KN, Potterb AC, Piccenna LG, et al.Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord[J].Brain Research Protocols, 2004, 12: 132 136.

  [8] Carriedo SG, Sensi SL, Yin HZ, et al.AMPA exposure induce mitochondrial Ca2+ overload and ROS generation in spinal motor neurons in vitro[J].J Neurosci, 2000, 20(1): 240-250.

  (编辑:郭光金)

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