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内皮型一氧化氮合酶在骨髓内皮祖细胞治疗缺血性脑血管病中的作用

首席医学网      2012年07月22日 15:10:18 Sunday  
 
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作者:卢桃利 罗 勇    作者单位:(重庆医科大学附属第一医院神经内科 重庆市神经病学重点实验室,重庆 400016)

【关键词】  内皮型一氧化氮(eNOS);内皮祖细胞;血管发生

  内皮型一氧化氮合酶(eNOS)/NO在血管新生和血管发生中起着重要作用。脑缺血时,缺血组织内的eNOS表达增加,促进NO的释放,有利于骨髓内皮祖细胞(EPCs)的动员、迁移、归巢。而EPCs能在缺血组织分化为成熟的血管内皮细胞,修复损伤的内皮,参与新生血管的形成,改善组织细胞的供血。本文就eNOS在EPCs治疗缺血性脑血管病中的可能作用做一综述。

  1997年之前,普遍的观点认为,在成年个体中只有血管新生这一种形式。而EPCs参与的从头形成血管的血管发生被认为只存在于胚胎形成期。日本学者Asahara等〔1〕首次从外周血中分离出CD34+、血管内皮生长因子受体(VEGFR)+细胞,并证实这类细胞同时具有内皮细胞和祖细胞的特点,于是提出了EPCs的概念。近年来,很多研究发现EPCs具有一定的增殖能力,在一定条件下能分化为成熟的血管内皮细胞,修复损伤的内皮,参与新生血管的形成,改善组织细胞的供血。大量的细胞因子如SDF-1、VEGF、G-CSF、趋化因子、整合素、选择素等参与EPCs的动员、迁移、归巢。尽管如此,关于这些因子的具体作用机制仍然存在争议。目前普遍关注的可能途径是PI3K/AKt通路,而对它的下游信号eNOS的研究相对较少。随着对EPCs研究的深入,关于EPCs与AKT/eNOS之间的关系将得到进一步研究。

  1 eNOS的基本生物学特点

  eNOS由一个二聚体结构组成,有二个相同亚基。每个亚基又分为两个结构区,c-端为还原区,含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及钙调蛋白(CaM)结合位点;N-端为氧化区,含有血红素、四氢生物蝶呤(BH4)、L-精氨酸等结合位点〔2〕。eNOS启动子含有SP1和GATA结构区,激活蛋白-1,激活蛋白-2,核因子-1,含有大量与转录因子相结合的位点,当该位点缺失或突变可使血管内皮细胞启动子活性减少90%~95%〔3〕。当内皮细胞因缺氧,在脂多糖和一些细胞因子作用下,可降低eNOS mRNA稳定性和基因转录水平的表达〔4〕。

  2 与eNOS活性相关的信号传导通路

  2.1 PI3K/AKt通路

  PI3K/Akt是细胞内重要的信号转导通路,在细胞的凋亡、存活以及增殖等活动中发挥重要的生物学功能。PI3K/Akt的下游信号因子包括GSK-3β、eNOS和mTOR等〔5〕。活化后的PI3K在膜上生成磷酸肌醇三磷酸〔phosphatidy linositol(3,4,5)trisphosphate,PIP3〕,PIP3通过与Akt蛋白的PH结构域相互作用,聚集Akt蛋白到膜上,在磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶(PDK)-1的帮助下,使Akt蛋白上的苏氨酸磷酸化位点(Thr308)和丝氨酸磷酸化位点(Ser473)磷酸化而使其激活。激活后的AKt可使下游信号分子eNOS的Ser1177磷酸化,从而增加NO生成,介导血管内皮细胞的迁移〔6〕。

  2.2 RHo/RHo-Kinase通路

  Rho/Rho-kinase信号通路的成分主要有三个:小G蛋白(主要是指Rho),与Rho相连的Rho激酶(Rho-kinase)和Rho-kinase的效应分子。Rho-kinase的效应分子包括:球蛋白轻链磷酸化酶(MLCP)和eNOS〔7〕。Rho/Rho-kinase信号通路能负性调节eNOS表达。抑制Rho/Rho激酶信号途径介导eNOS表达上调并非诱导eNOS基因转录,而是在转录后通过延长eNOS mRNA半衰期、增加eNOS mRNA稳定性来实现的〔8〕。体外培养的人脐静脉内皮细胞上发现,RockI1不仅下调eNOS mRNA表达,而且抑制eNOS第1177位丝氨酸磷酸化,从而抑制NO产生。

  3 eNOS在血管生成中的作用

  3.1 eNOS促血管发生

  血管发生是指原始血管网的形成,通过血管母细胞分化为内皮细胞形成迷宫样的血管网络,主要涉及EPCs的参与。eNOS促进血管发生主要是通过促进多种细胞因子诱导EPCs的动员、迁移、归巢实现的。崔斌等〔9〕证实VEGF可剂量依赖型地增加EPCs的数量,并促进EPCs的增殖、迁移、黏附能力,而VEGF的这种功能可能是通过PI3K/AKt通路上调eNOS mRNA的表达而发挥作用的。Zheng等〔6,10〕用SDF-1的抑制剂(AMD3100),PI3K的抑制剂(LY294002和Wortmannin),eNOS抑制剂(NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester)进行干预,均能抑制SDF-1促进EPCs迁移的能力;然而,用MAPK/ERK的抑制剂进行干预,并没有影响SDF-1的促迁移能力。该实验说明PI3K/AKt/eNOS通路参与SDF-1介导的EPCs迁移。该实验组还发现SDF-1抑制EPCs凋亡也是通过PI3K/AKt/eNOS通路介导的。促红细胞生成素(EPO)也能通过诱导AKt的磷酸化促进EPCs从骨髓动员到外周血,提高EPCs的增殖和血管再生能力〔11〕。

  3.2 eNOS促血管新生

  血管新生是指新生的毛细管从已存在的血管侧支的出芽与重塑,主要是血管内皮细胞(EC)的参与。NO促血管新生有4点理由:①缺血诱导eNOS的mRNA和蛋白质表达增加,使NO的释放也增加;②NO通路的破坏可降低缺血后的血管新生;③NO供体能促进缺血后的血管新生;④心脑血管疾病能降低NO的合成,削弱缺血后血管新生〔12〕。同时eNOS可增加MMPs的活性,降解细胞外基质,促进EC的迁移及血管新生。Zhang等〔13〕通过给大鼠注射一种NO的外源性供体DETANONOate,大鼠新生毛细血管数目和内皮细胞计数在缺血周围区增加显著,VEGF表达上调。研究表明,NO可能是通过NO/cGMP路径增加缺血后的VEGF的表达和血管新生。Namba等〔14〕将携带eNOS基因的质粒转入大鼠缺血下肢,发现转染后eNOS蛋白表达明显增加,组织中的硝酸盐及亚硝酸盐浓度也明显增加,但其可被eNOS抑制剂L-NAME完全抑制。eNOS的过度表达可促进缺血组织血流及毛细血管密度,且VEGF的表达也增加;但L-NAME可抑制eNOS的这种促进作用。

  3.3 eNOS促动脉形成及侧支生成

  动脉形成是指由于动脉阻塞,血流再分配使侧支微动脉血流量增加、血管内剪切力增加,引起细胞增殖、血管重塑而形成大的有功能的侧支动脉。Cui等〔15〕的实验说明,eNOS-/-的小鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖能力降低,给予NO的供体DETANONOate能改善VCMCs的迁移,因此在动脉的形成过程中eNOS/NO参与调节VSMCs的增殖、迁移。Cai等〔16〕也发现eNOS的表达与侧支循环的建立密切相关,eNOS在动脉形成中发挥重要作用。Wu等〔17〕通过猪后肢缺血模型也证实动脉形成时,eNOS被激活,表达上调,即eNOS具有促EC增殖的能力,有利于侧支血管的生长。动脉形成可以形象地描述为两条动脉完全吻合成一条具有功能的动脉。在这一过程中,血管壁的扩张是通过壁细胞:ECs和VSMCs的增殖、迁移实现的,即EC、VSMCs分化或者转分化为管状结构。

  4 eNOS在EPCs治疗缺血性脑血管病中的作用

  2004年,Chen等〔18〕

  报道联合给予hMSCs和NO的供体NONOate能促进脑卒中后的血管再生和神经再生有利于神经行为学的恢复。该实验把MCAO 2 h/R 24 h 的大鼠分为4组:①给予PBS 1 ml;②给予NONOate 0.4 mg/kg;③给予hMSCs 1×106;④联合给予NONOate 0.4 mg/kg+hMSCs 1×106。功能分析和免疫组化分析得出,hMSCs组梗死边缘区功能恢复,而NONOate组无明显改变。但NONOate+hMSCs联合组功能恢复、血管管径及EC的增殖能力均明显改善;SVG区Brdu阳性细胞数、缺血区VEGF和bFGF的表达较对照组有显著提高。hMSCs能通过旁分泌的方式分泌VEGF和bFGF等细胞因子,VEGF能刺激EC表达eNOS,eNOS与L-精氨酸结合生成NO能促进血管新生和神经再生。NO供体药物疗法和hMSCs干细胞移植的联合应用为治疗脑卒中提出了新的途径,也为研究eNOS参与EPCs治疗缺血性脑血管病奠定了基础。eNOS能通过介导某些细胞因子及药物等促进缺血性脑血管病的恢复。

  4.1 细胞因子

  G-CSF是一种有效的神经保护因子,即能促进内皮细胞的增殖,动员干细胞到外周血,改善脑缺血后的功能恢复。Lee等〔19〕把tMCAO 90 min/R的大鼠随机分为2组:一组给予G-CSF(50 μg/kg),另一组给予生理盐水。用Western印迹法检测到给予G-CSF组eNOS(上调6.5倍)和Ang2(上调2.18倍)的表达均上调,且较对照组有意义。这与eNOS基因缺失的小鼠,注入G-CSF不能增加EPCs的数量相一致。因此,eNOS在G-CSF促进脑缺血后的血管生成和EPCs的动员中有着一定的作用。郭伟新等〔20〕通过密度梯度离心法分离出脑梗死(发病48 h)患者外周血中的单核细胞并通过培养获得EPCs后,再加入不同浓度的NGF培养24 h,观察EPCs数量、迁移、增殖、黏附及成血管能力,同时检测PKB,eNOS蛋白表达。结果表明NGF能改善脑梗死患者EPCs的数量、迁移、增殖及成血管能力,促进损伤血管的修复,而NGF的这些作用与PKB/eNOS信号通路有关。

  4.2 药物

  目前已经公认他汀类药物能够动员骨髓EPCs到外周血,通过激活EC的AKt/eNOS促进血管形成。陈雅玲等〔21〕通过用阿托伐他汀治疗急性缺血性脑卒中发现用阿托伐他汀治疗第2周开始EPCs数量逐渐增多,且第3周和第4周增多较为显著;EPCs的迁移能力在第2和第3周也得到显著提高。Ma等〔22〕用不同剂量的洛伐他汀与或者不与AKt抑制剂曲西立滨共同培养24 h,再暴露在oxLDL环境下48 h,发现洛伐他汀能通过调节AKt/eNOS通路和eNOS的基因转录改善EPCs的动员,迁移及血管生成的能力。Yin等〔23〕的研究表明血管紧张素Ⅱ与其受体结合后能促进血管新生,可能机制是AngⅡ能激活eNOS,诱导NO的产生,调控EPCs的黏附和凋亡,且AngⅡ抗凋亡作用与PI3K/AKt有关。Shi等〔24〕发现人参皂苷RG1能促进EPCs的增殖,迁移及促血管发生。且人参皂苷RG1能激活PI3K/AKt通路促进VEGF的合成和血管再生,在TNF-a的作用下能使eNOS磷酸化促进NO的生成。药物对EPCs直接动员以促进缺血区的血管再生将会成为脑梗死临床治疗的一个重要途径,目前这方面的研究相对较少。

  4.3 电针

  电针能通过上调eNOS的表达,下调nNOS、iNOS的异常表达,发挥神经保护作用〔25〕。蔡绍皙等〔26〕用电针刺激MCAO/R模型大鼠单侧“ 足三里”、“曲池”后,检测EPCs的数量和VEGF的含量及总一氧化碳合酶(TNOS)、诱生型一氧化碳合酶(iNOS)的活力,发现针刺24 h外周血EPCs数量和血清TNOS、iNOS活力及VEGF的含量都明显升高。TNOS分为nNOS、eNOS、iNOS,eNOS对脑缺血损伤的血管有保护作用,它的激活可以促进基底膜降解,与VEGF一起参与EPCs动员。

  4.4 其他

  目前有报道体育锻炼能上调eNOS,在EPCs促进脑缺血后的功能恢复方面发挥重要作用。Gertz等〔27〕将MCAO 30 min/R的野生型大鼠在滑轮机上连续跑步后发现不仅能上调血管内皮产生的eNOS,还能促进骨髓和脾产生EPCs,增加循环中EPCs的数量有利于血管的生成。同时移植的TIE2/LacZ阳性BM细胞的数量在缺血脑组织也上升,4 w后经历连续跑步的大鼠有新的细胞出现,微血管密度增加,缺血区的CBF也增加。但以上结果在存在eNOS抑制剂,eNOS表达缺失或者在使用促血管新生抑制剂后均受到抑制。总之,体育锻炼改善脑卒中后转归促血管生成,增加脑血流量和EPCs的数量,这些作用依赖eNOS。

  eNOS在治疗缺血性脑卒中的作用可以总结为以下几点:①增加脑血流量;②加强内皮依赖型血管舒张;③抗炎;④抗氧化损伤;⑤抗血小板聚集;⑥抗血栓形成;⑦抗凋亡;⑧动员干/祖细胞;⑨促血管生成。

  5 结 语

  在EPCs的动员、迁移、归巢、分化及促血管生成方面,PI3K/AKt是一条非常重要的调控通路磷酸化的AKt可使下游信号分子eNOS的Ser1177磷酸化,从而增加NO生成。生成的NO一方面可通过扩张血管、抑制血小板聚集及白细胞黏附,增强侧支循环和防止微血管堵塞改善脑缺血后血流,还可以调节内皮细胞的破坏,参与血管生成;另一方面NO能促使MMP-9硝基化使mKitL变sKitL促进骨髓EPCs的动员、迁移、归巢等一系列下游反应。eNOS参与了EPCs的动员、迁移、归巢及分化,在血管生成及神经再生过程中发挥重要作用。这将为进一步认识EPCs,探讨EPCs在治疗缺血性脑血管病的机制提供新的思路。

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  (编辑 张 慧)

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