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原花青素对阿尔茨海默病模型大鼠脑组织的预防保护作用

首席医学网      2012年07月22日 14:15:22 Sunday  
 
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作者:蔡洪斌 王 峰1 张义军1      作者单位:1 潍坊医学院(淄博市周村区精神病医院,山东 淄博 261053)

【摘要】  目的 探讨葡萄籽原花青素(GSP)对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠脑组织的预防保护作用和其机制。方法 Wistar大鼠60只随机分为4组:空白对照组、AD模型组、GSP大剂量(40 mg/kg)组、GSP小剂量(20 mg/kg)组,每组15只,大鼠海马区注射凝聚态Aβ1~40制作AD模型成功后,先观察大鼠的认知功能,然后检测海马区脑组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、ATPase活性,免疫组织化学染色检测海马区脑皮质神经细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达,Hoechst33258染色观察海马区脑皮质神经细胞凋亡情况。结果 原花青素能明显改善AD大鼠的认知功能,使大鼠脑组织MDA含量明显降低,SOD、ATPase活性明显升高, Bcl-2蛋白表达明显升高,Bax蛋白表达显著降低。结论 GSP对AD模型大鼠的认知功能有一定的改善作用;GSP可通过清除自由基和抗脂质过氧化作用来提高AD模型大鼠脑组织的抗氧化能力;GSP对AD模型大鼠神经细胞凋亡有明显的抑制作用。

【关键词】  原花青素;阿尔茨海默病;抗氧化剂;自由基;细胞凋亡

  阿尔茨海默病(AD)作为老年性痴呆的一种重要类型,是中枢神经系统的一种渐进性退行性疾病,其病因及发病机制尚不清楚。淀粉样蛋白及氧化应激是AD发病过程中的一个关键性因素已基本得到公认。原花青素(PC)是一类广泛存在于植物界的具有抗氧化作用的多酚化合物,作为PC的理想来源葡萄籽原花青素(GSP)系从葡萄籽中提取分离制得的一种新型高效抗氧化剂,其原花青素含量高达95%,得到深入广泛的关注。葡萄籽原花青素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、减轻缺血再灌注损伤、抗突变、抗病毒等保护作用。本实验应用组织病理学、免疫组织化学和酶学等方法探讨GSP在体内对AD大鼠的防治作用及机制,从而为临床治疗AD提供实验依据。

  1 材料与方法

  1.1 材料药品试剂与仪器

  健康Wistar大鼠65只,体重250~300 g,雌雄不拘,由山东鲁抗集团动物中心提供。β-淀粉样肽Aβ1~40(美国Sigma公司) 原花青素:天津尖峰天然产物研究公司(批号:G050804)提供。Bax兔抗鼠抗体和Bcl-2兔抗鼠抗体和DAB均购自北京中杉生物技术有限公司;SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;Hoechst33258细胞凋亡染色试剂盒:碧云天生物工程有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒;丙二醛(MDA)试剂盒;ATP酶试剂盒考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。批号分别是20100514、20100514、20100515、20100515,江湾Ⅰ型大鼠立体定向仪,Morris水迷宫装置(中国医学科学院药物研究所),德国贺利氏仪器公司PRIM-R台式高速低温离心机;日本OLYMPUS公司BH-2型生物光学显微镜及照相系统;日本Sanyo公司 MDF-330型立式超低温冰箱等。

  1.2 AD模型的制备及给药

  65只Wistar大鼠经Morris水迷宫测试判定其空间辨别性学习记忆能力,淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠5只,将选出的大鼠随机分为4组,AD模型组、空白对照组、GSP大剂量组和GSP小剂量组每组15只。AD模型组、GSP组大鼠经麻醉后,于立体定位仪下以Aβ1~40行双侧海马内注射,每侧各1 μl (预先将Aβ1~40溶于无菌生理盐水10 μg/μl用前在37℃下孵育1 w〔1〕)。空白对照组注射等量的生理盐水。GSP组于建模后24 h开始按大剂量组40 mg/kg,小剂量组20 mg/kg灌胃给药,持续4 w,空白对照组按200 mg/kg生理盐水灌胃。各组术后均单笼饲养至大鼠完全清醒。

  1.3 大鼠认知功能观察

  术后第2周开始进行认知功能观察,Morris水迷宫行为测定:历时5 d,第1天让大鼠自由游泳2 min;第1天第2次开始训练,随后每天训练4次,共5 d。训练时选择一个入水点,将大鼠面向池壁放入水中,观察并记录大鼠寻找并爬上平台的路线图、所需时间(潜伏期)及各象限的游泳距离和时间。如果大鼠在60 s内未找到平台,需将其引至平台。这时潜伏期为60 s,每次训练间隔30 s。数据采集和处理由Morris迷宫图像自动监视处理系统完成。

  1.4 标本制备及指标测定

  断头取两海马区皮质,电子天平称取一侧脑组织块约0.1 g,冰冷生理盐水冲洗残余血液,滤纸拭干,加入Tris缓冲液用玻璃匀浆器制成10% 的脑组织匀浆,4℃离心3 500 r/min,15 min,取上清液进行MDA、SOD、ATPase的测定备用。另一侧于固定液中固定分别用于免疫组织化学指标的测定。

  1.5 统计学处理

  应用统计软件SPSS11.5进行统计分析。所有数据均用x±s表示,各组间比较采用方差分析。

  2 结 果

  2.1 各组大鼠的认知功能

  GSP能明显改善AD大鼠认知能力,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),GSP大小剂量组之间无显著差异(P>0.05),见表1。

  2.2 各组大鼠脑组织SOD、MDA及ATPase比较

  海马区脑组织MDA含量、SOD及ATPase活性变化:GSP组与空白对照组比较脑组织MDA含量明显升高,SOD、ATPase活性明显降低(P<0.05);GSP用药组与AD模型组比较脑组织MDA含量明显降低,SOD、ATPase活性明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、表3。

  2.3 各组大鼠海马皮质Bcl-2、Bax表达

  免疫组织化学及图像分析:GSP组与空白对照组比较海马区脑皮质神经细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达升高(P<0.05),与模型组比较Bcl-2蛋白的表达明显升高,Bax蛋白的表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4;图1,图2。

  2.4 各组大鼠海马区神经细胞凋亡情况

  Hoechst33258染色结果:与空白对照组神经细胞凋亡率〔(13.84±0.84)%〕比较,AD模型组凋亡率明显增高〔(53.24±2.47)%,P<0.05〕,大、小剂量GSP用药组较AD模型组细胞凋亡率显著降低,差异有统计学意义〔(21.19±1.52)%,(34.44±1.54)%,P<0.05〕。见图3。图1 各组大鼠海马皮质Bcl-2表达(DAB,×400)图2 各组大鼠海马皮质Bax表达(DAB,×400)图3 各组大鼠海马区神经细胞凋亡情况(×400)表1 GSP对各组AD大鼠认知能力影响的测试结果  表2 各组大鼠脑组织MDA含量、SOD活性表3 各组大鼠脑组织ATPase活性表4 各组大鼠缺血侧半暗带颞顶部皮质Bcl-2、Bax蛋白表达阳性率

  3 讨 论

  AD是老年期以渐进性记忆力和智能减退为特征的弥漫性中枢神经系统退行性疾病。AD的特异性早期诊断和有效的防治措施还远远没有解决。主要原因是AD的发病机制十分复杂,目前还缺乏有效的干预手段。国内外众多实验和临床研究证实,自由基引起的氧化损伤是不同病因诱发神经退行性疾病最后的共同通路,氧化应激参与了AD的病理过程〔2〕。大量的自由基不能被及时清除,则损伤生物大分子包括蛋白质、DNA和脂质过氧化,致使神经细胞凋亡〔3〕进而导致或加重AD。神经细胞的死亡和缺失是导致学习和记忆障碍的主要因素,MDA就是自由基攻击机体产生的终产物之一,因此测试MDA的含量常常可反映机体脂质过氧化的程度。ATPase和SOD是机体内清除自由基的关键酶,它们可以保护机体不受自由基的损伤,对它们的监测可以反映出机体抗氧化能力的强弱。

  原花青素具有很强的抗氧化活性,是一种良好的氧自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂。Koga等一次性给予禁食大鼠GSP25 mg/kg,研究其对大鼠血浆抗氧化水平的影响〔4〕。分别取原花青素组和对照组大鼠血浆,与硫酸铜或2-咪唑丙烷双氢盐酸37℃孵化。与对照组比较,原花青素组大鼠血浆对硫酸铜或2-咪唑丙烷双氢盐酸氧化诱导形成的胆固醇过氧化氢酯(ChE-OOH)更具有抵抗力。说明摄入原花青素可提高血浆对氧化应激的抵抗力。Bouhamidi用UV-C(200~290 nm)照射介导多不饱和脂肪酸的过氧化作用,受到2 mg/L葡萄籽原花青素的抑制〔5〕。在一项使用大鼠肝、脑组织的体外实验中〔6〕,分别以CCl4、H2O2和铁离子-抗坏血酸(Fe2+-VC)激发脂质过氧化作用。结果表明,GSP可明显降低大鼠肝、脑组织自发性MDA的生成,减轻CCl4、H2O2和Fe2+-VC所致的肝脏脂质过氧化反应,减轻肝组织还原型谷胱甘肽耗竭。提示GSP具有良好的抗脂质过氧化作用。研究显示山葡萄籽中的五种多酚类物质-(+)-儿茶素、原花青素B2、原花青素B5、原花青素B5-3′-O-gallate和山葡萄素的抗脂质过氧化作用〔7〕。发现这五种物质对小鼠肝匀浆过氧化脂质生成的半数抑制浓度(IC50)分别为0.47、0.25、0.10、0.02和0.03 mmol/L。阳性对照维生素E的IC50为0.13 mmol/L。构效分析提示,具有没食子酰基结构的原花青素抗脂质过氧化活性更强,二聚体抗脂质过氧化活性比单体更强。原花青素B5、原花青素B5-3′-O-gallate和山葡萄素的抗氧化活性比维生素E强。Simoneti的研究〔8〕结果表明,摄入的原花青素减少脂溶性维生素的消耗,减轻了DNA氧化的损伤,从而实现其体内的抗氧化作用。Bagchi〔9〕发现在100 mg/kg剂量下GSP、VC、VE、β-胡萝卜素均可降低TPA诱导产生的活性氧,葡萄籽原花青素对于抑制诱导的腹腔巨噬细胞活性氧的产生,具有剂量反应关系,其作用优于其他抗氧化剂。此外Bagchi的体外实验也获得了相似的结果〔10〕。

  本实验研究结果表明葡萄籽原花青素对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠脑组织具有一定的保护作用,其可能的机制为:通过其抗氧化活性提高清除氧自由基能力,减少脂质过氧化反应,减轻氧自由基对脑组织的损伤;提高ATPase活性改善细胞内外离子交换,减轻能量代谢障碍;提高Bcl-2的表达并降低Bax的表达抑制神经细胞凋亡。GSP作为一种天然高效抗氧化剂不仅毒副作用低,而且可通过清除自由基、改善能量代谢障碍及抑制细胞凋亡多方面保护脑组织缺血再灌注损伤,本实验研究为GSP作为临床AD防治药物的研究与开发提供实验依据,期待更深一步的研究。

【参考文献】
   1 Miguel-Hidalgo JJ,Cacabelos R.β-amyloid(1-40)-induced neuro-degeneration in the rat hippocampal neurons of the CA1 subfield〔J〕. Acta Neuropathol,1998;95:455-65.

  2 Christen Y,Oxidative stress and Alzheimer disease〔J〕.Am Jclin Nutr,2000;71(suppl):621-9.

  3 于如同,李 祥,高立达,等.氧化应激诱导神经细胞凋亡与c-M yc、Fas-FasL、核因子-B关系的研究〔J〕.中华创伤杂志,2003;19(6):344-7.

  4 Koga T,Moro K,Nakamori K,et al.Increase of antioxidative potential of rat plasma by oral administration of proanthocyanidin-rich extract from grape seeds〔J〕.Agric Food Chem,1999;47(5):1892-7.

  5 Bouhamidi R,Prevost V,Nouvelot A.High protection by grape seed proanthocyanidins (GSPC) of polyunsaturated fatty acids against UV-C induced peroxidation〔J〕.C R Acad Sci Ⅲ,1998;321(1):31-8.

  6 郭 英,蔡秀成,陈秋丽,等.葡萄籽提取物的体外抗脂质过氧化作用〔J〕.卫生研究,2002;31(1):28-30.

  7 Wang JN,Chen YJ,Hano Y,et al.Antioxidant activity of polyphenols from seeds of Vitis amurensis in vitro〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2000;21(7):633-6.

  8 Simoneti P,Ciappellano S,Gardana C,et al.Procyanidins from Vitis vinifera seeds:in vivo effects on oxidative stress〔J〕.J Agic Food Chem,2002;50(21):6217-21.

  9 Bagchi D,Grag A,Krohn RL,et al.Protective effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidant against TPA-induced hepatic and brain lipid peroxidation and DNA fragmentation,and peritoneal macrophage activation in mice〔J〕.Gen Pharmacol,1998;30(5):771-6.

  10 Bagchi D,Grag A,Krohn RL,et al.Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E,and a grape seed proanthocyanidin extractin vitro〔J〕.Res Comm Molecu Pathol Pharm,1997;95(2):179-89.

  (编辑 曹梦园)

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