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缺氧诱导因子-1在糖尿病肾病大鼠肾脏的表达水平

首席医学网      2012年07月22日 14:07:57 Sunday  
 
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作者:李 君 王庆丽1 孙 湘1 王济芳1 高 頔2 俞 力1    作者单位:1 江苏大学附属医院 2 江苏大学职工医院 (江苏大学附属金坛医院内分泌科,江苏 金坛 213200)

【摘要】  目的 探讨吡格列酮干预对糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏缺氧诱导因子-1(HIF-1)表达水平的影响及对过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)表达的影响。方法 单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠模型,将糖尿病大鼠随机分为DN组(20只)和吡格列酮组(P组,20只),以正常大鼠(C组,20只)作对照。干预8 w后,观察各组大鼠尿蛋白、血糖、血脂、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)变化;用实时荧光定量PCR分析肾脏HIF-1、PPARγ mRNA的表达。结果 (1)DN组大鼠尿蛋白、肾脏HIF-1蛋白及mRNA水平均较正常大鼠明显升高,PPARγ表达下调;而P组大鼠上述指标呈现相反的改变,24 h尿蛋白定量分别与 HIF-1蛋白、mRNA水平呈显著正相关。(2)DN组大鼠血糖、血脂均显著高于正常大鼠,吡格列酮治疗后上述指标无明显变化。结论 吡格列酮可能通过PPAR途径下调DN大鼠肾脏HIF-1表达,从而发挥其肾保护作用。

【关键词】  糖尿病肾病;吡格列酮 ;缺氧诱导因子-1

  糖尿病肾病(DN)肾脏损害主要表现为微血管病变。研究表明,DN的发病机制与血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-β)以及结缔组织生长因子(CTGF)等分子介质参与的分子信号通路密切相关〔1,2〕。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是哺乳动物和人体细胞内存在的一类介导缺氧适应性反应的转录因子,能激活许多缺氧反应性基因的表达。HIF-1对许多在急、慢性肾脏疾病发生、发展过程中起关键作用的体液因子具有调节作用,包括TGF-β、CTGF及VEGF等分子介质〔3〕。研究还发现,过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)激动剂吡格列酮在临床中能改善DN病人尿微量白蛋白,延缓DN的进展〔4,5〕,但有关吡格列酮在DN中的作用机制尚不甚清楚。本研究试图通过探讨HIF-1在DN大鼠肾脏的表达水平,研究其在DN发生发展中所起的作用,并进一步观察吡格列酮对DN大鼠肾脏HIF-1表达水平的影响,探讨其肾脏保护作用及可能的机制。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  STZ购自Sigma公司;吡格列酮原粉由德源药业提供;兔抗HIF-1多克隆抗体及小鼠抗PPARγ单克隆抗体(1∶100)购自美国Invitrogen公司;Trizol购自ABI基因公司;引物序列由上海生物工程技术服务公司合成;绿色荧光核酸染料(SYBR Green)荧光定量PCR试剂盒购自广州达晖生物公司;ABI Prism 7300 SDS PCR仪为美国ABI公司产品。

  1.2 方法

  1.2.1 动物模型的建立与分组

  雄性SD大鼠,体重160~230 g,由江苏大学医学院动物实验中心提供。大鼠按50 mg/kg一次性腹腔注射1 %链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病模型。注射72 h后尾静脉采血,血糖>16.7 mmol/L纳入糖尿病模型。将糖尿病大鼠随机分为两组,DN组(n=20)和吡格列酮组(P组,n=20,吡格列酮原粉,蒸馏水配制,15 mg/kg灌胃)。另设正常对照组(C组,n=20),C组与DN组以等量蒸馏水灌胃。糖尿病大鼠24 h尿蛋白≥30 mg/d〔3〕。

  1.2.2 标本收集及检测

  吡格列酮干预12 w后处死大鼠。处死前收集24 h尿,测尿微量白蛋白,全自动生化分析仪测尿肌酐。强生血糖仪检测血糖,全自动生化分析仪测血脂、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)。并计算内生肌酐清除率(Ccr),Ccr=尿肌酐/SCr×24 h尿量。取肾脏,部分-70℃冻存以备荧光定量PCR检测;甲醛固定并石蜡包埋切片,以备免疫组织化学检查。

  1.2.3 肾脏形态学观察

  肾组织经固定,常规脱水,石蜡包埋,切成4 μm厚切片,行苏木素-伊红(HE)染色。

  1.2.4 实时荧光定量

  PCR测定HIF-1、PPARγ mRNA HIF-1引物设计使用Primers软件,上游:5′-AGCCCTAGATGGCTTTGTGA-3′,下游:5′-TATCGAGGCTGTGTCGACTG-3′;PPARγ引物序列上游:5′-AAGACCACTCGCATTCCTTTGA-3′,下游:5′-GTCATATTTGTAATCAGCAACCATTGG-3′,152 bp;β-actin:上游引物5′-GACGGTCAGGTCATCACTATCG-3′,下游引物5′-ACGGATGTCAACGTCACACTTC-3′。实时定量PCR反应参数:预变性94℃ 15 min,然后94℃变性20 s,60℃退火40 s,72℃延伸30 s,共35个循环。每个循环后采集荧光生成扩增曲线,并在反应后生成熔点曲线。计算方法:待测样品mRNA相对表达量=2-ΔCT×100%;ΔCT=目标基因CT值-内参(以管家基因β-actin为内参)CT值,采用仪器自带软件分析各组HIF-1、PPARγ mRNA的相对表达量。

  1.3 统计学方法

  应用SPSS15.0统计软件进行分析,计量资料用x±s表示,各组间均数比较采用单因素方差分析。

  2 结 果

  2.1 吡格列酮对DN大鼠血糖、血脂的影响

  与C组相比, DN组大鼠血糖(BG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)增高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与DN组相比,P组大鼠上述各指标差异均无统计学意义。见表1。表1 吡格列酮对DN大鼠血糖、血脂的影响

  2.2 吡格列酮对DN大鼠肾功能的保护作用

  与C组相比,DN组大鼠BUN、SCr、尿蛋白增高,Ccr降低,差异有统计学意义(P<0.01);与DN组相比,P组大鼠尿蛋白、BUN、Scr均有明显下降,Ccr上升(P<0.05或P<0.01)。见表2。  表2 吡格列酮对DN大鼠尿蛋白、BUN、Scr、Ccr水平的影响

  2.3 肾组织病理形态学变化

  光镜 HE染色显示:与 C组相比,DN组表现出明显的肾小球体积增大,系膜细胞增多,基质增生,并可见肾小管上皮细胞水肿;而P组与 DN组比较,肾小球体积减小,系膜细胞数减少,系膜基质轻微增生,部分小管上皮开始出现修复。见图1。图1 吡格列酮对糖尿病模型大鼠肾脏  组织形态的影响(HE,×400)

  2.4 吡格列酮降低DN大鼠肾脏HIF-1 mRNA的表达

  实时荧光定量PCR结果显示,DN组大鼠肾脏HIF-1 mRNA表达(0.78 ±0.33)比C组(0.23±0.18)增多,差异有统计学意义(P<0.05);P组HIF-1 mRNA表达(0.54±0.14)低于DN组(P<0.05)。24 h尿蛋白定量与HIF-1 mRNA表达呈显著正相关(r=0.68,P<0.01)。

  2.5 吡格列酮上调DN大鼠肾脏PPARγ mRNA的表达

  实时荧光定量PCR结果显示,DN组大鼠肾组织PPARγ mRNA表达(0.69±0.24)较C组(1.67±0.59)减少(P<0.01);P组PPARγ mRNA表达(1.32±0.38)高于DN组(P<0.01)。

  3 讨 论

  DN的早期改变与局部微血管结构和功能改变密切相关。缺氧和微血管病变对进展性肾脏疾病起重要作用〔6〕本实验提示HIF-1表达上调参与了DN的发生发展,并与肾功能减退、蛋白尿产生密切相关。

  近来国外研究了吡格列酮对DN的肾保护作用,发现可能与激活组织的PPARγ有关〔7〕。本实验结果提示吡格列酮降低蛋白尿、抑制HIF-1表达的作用可能与激活PPARγ有关。HIF-1能够诱导VEGF的表达〔8〕,因此推测在DN大鼠模型中,吡格列酮通过激活PPARγ,下调HIF-1的表达来发挥肾保护作用。本实验说明吡格列酮减少蛋白尿的作用并非由于降低了血糖和血脂。在控制糖尿病代谢紊乱的同时,积极降低各种细胞因子的表达,减少在细胞水平引起的损伤对减轻或预防DN有重要意义。降低HIF-1的表达可能是一个有吸引力的目标,PPARγ激动剂吡格列酮可能通过PPAR途径下调DN大鼠肾脏HIF-1表达,并减少尿蛋白、发挥直接肾保护作用。

【参考文献】
    1 Palm F,Hansell P,Ronquist G,et al.Polyol-pathway-dependent disturbances in renal medullary metabolism in experimental insulin-deficient diabetes mellitus in rats〔J〕.Diabetologia,2004;47:1223-31.

  2 高国丽,车光升,董 瑶,等.糖尿病肾病发病机制的研究进展〔J〕.中国老年学杂志,2007;27(22):2254-5.

  3 Belaiba R,Bonello S,Zahringer C,et al.Hypoxia up-regulates hypoxia-inducible factor-lα transcription by involving phosphatidylinositol 3-kinase and nuclear factor κB in pulmonary artery smooth muscle cells〔J〕.Mol Biol Cell,2007;18(12):4691-7.

  4 Sarafidis PA,Bakris GL.Protection of the kidney by thiazolidinediones:an assessment from bench to bedside〔J〕.Kidney Int,2006;70(7):1223-33.

  5 Pistrosch F,Herbrig K,Kindel B,et al.Rosightazone improves glomerular hyperfiltration,renal endothelial dysfunction,and microalbuminuria of incipient diabetic nephropathy in patients〔J〕.Diabetes,2005;54(7):2206-11.

  6 Izuhara Y,Nangaku M,Inagi R,et al.Renoprotective properties of angiotensin receptor blockers beyond blood pressure lowering〔J〕.J Am Soc Nephrol,2005;16(12):3631-41.

  7 Higashi K,Oda T,Kushiyama T,et al.Additive antifibrotic effects of pioglitazone and candesartan on experimental renal fibrosis in mice〔J〕. Nephrology (Carlton),2010;15(3):327-35.

  8 Abu El-Asrar AM,Missotten L,Geboes K.Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha and the protein products of its target genes in diabetic fibrovascular epiretinal membranes〔J〕.Br J Ophthalmol,2007;91(6):822-6.

  (编辑 袁左鸣/徐 杰)

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