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依达拉奉对慢性脑缺血模型大鼠脑组织丙二醛、超氧化物歧化酶阳性表达的影响

首席医学网      2012年07月22日 14:13:45 Sunday  
 
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作者:薛慎伍 刘春寒 张兆岩 薛 源 于晓敏 钟 莉 王 辉 胡金娜 孔素梅    作者单位:(济南军区总医院干部四科,山东 济南 250031)

【摘要】  目的 本文应用依达拉奉与脑蛋白水解物治疗慢性脑缺血实验研究,通过观测丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量探讨慢性脑缺血治疗的有效性。方法 线结扎离断法制作大鼠颈动脉的局灶性慢性脑缺血模型,造模3 w后给予依达拉奉3 mg/kg腹腔注射,于不同时间点用卒中指数评分标准和神经病学症状标准评估大鼠神经功能损伤程度,用各实验组大鼠脑组织匀浆测定MDA和SOD的含量。结果 脑缺血模型鼠卒中指数1~3 d死亡率为35%~38.9%,显著高于正常对照组;脑缺血4 w MDA含量升高明显,12 w恢复正常,依达拉奉和脑蛋白水解物组与正常对照组、脑缺血模型组比差异有显著性(P<0.01),且脑蛋白水解物MDA含量增加不如依达拉奉组显著(P<0.01);脑缺血模型组和给药组在4 w时SOD含量明显减少,依达拉奉组和脑蛋白水解物组在8 w、12 w额叶皮层与海马区SOD的表达均显著高于脑缺血模型组(P<0.01),且依达拉奉组各时点SOD的含量均高于脑蛋白水解物组(P<0.01),但16 w后SOD含量恢复正常,脑缺血模型组在12 w时额叶皮质及海马区SOD含量明显低于正常对照组(P<0.01)。结论 慢性脑缺血是痴呆的病理基础,梗死灶多发生在缺血的2~4 w,以分水岭区较多见;依达拉奉具有抑制缺血后血管内皮细胞损害,清除自由基、抑制脑水肿,影响单胺类神经递质的代谢,而发挥神经保护作用,其有效性优于脑蛋白水解物。

【关键词】  慢性缺血;依达拉奉;脑蛋白水解物;丙二醛;超氧化物歧化酶

  目前,国内外大多为急性脑缺血形成机制与治疗探讨的报告。但慢性脑缺血大脑皮层不同区域对神经功能影响和生物分子学表达的意义及抗自由基治疗的有效性研究较少。依达拉奉具有阻止脑缺血及缺血再灌注损伤引起的脑水肿、脑梗死的进展,缓解所伴随症状,抑制脂质近氧化酶,从而抑制脑细胞、内皮细胞、神经细胞的氧化损伤。本文从依达拉奉治疗的有效性与大脑缺血区丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)表达的水平比较,判断依达拉奉在慢性缺血治疗中的优劣。

  1 材料与方法

  1.1 实验动物及分组

  健康雄性Wistar大鼠78只,鼠龄12~16 w,体质量260~300 g,由山东医科大学动物实验中心提供,设正常对照组6只。制作模型成功后随机分为脑缺血模型组24只(脑缺血1个月),依达拉奉药物组24只(脑缺血1个月),按3 mg/kg,腹腔注射依达拉奉,每日1次。脑蛋白水解物药物组24只(脑缺血1个月),按3 mg/kg,腹腔注射脑水解蛋白物,每日1次。

  1.2 动物模型制备

  用5%氯胺酮注射液(0.2 ml/100g)腹腔注射麻醉后,大鼠仰卧位固定手术台上,保证手术操作期间大鼠有自主呼吸,颈部脱毛、碘消毒,颈正中切口,分离双侧颈总动脉,并套以“0”号线,分别结扎双侧颈总动脉的远近端,并从中间剪断,确保阻断动脉血流,缝合肌肉皮肤,放回笼中饲养。对照组大鼠麻醉及手术过程与手术组相同,但不结扎颈总动脉。术后3 w腹腔注射药物,1次/d,直至处死,进行指标测定。

  1.3 观察指标

  手术后1、3、7、14、28 d分别对术后大鼠进行卒中指数、神经病学症状进行评定;手术后2、4、8、12、16 w测定大鼠学习记忆能力;手术后4、8、12、16 w行MDA和SOD检测。

  1.4 动物模型评价标准与检测方法

  1.4.1 卒中指数评分标准

  总分25分:0~3分为无症状组;3~9分为中间组,可能有损伤;≥10分为症状明显,有损伤。

  1.4.2 神经病学症状评分标准

  总分10分:0分正常;1~3分为轻度损伤;4~6分为中度损伤;7~10分为严重损伤。

  1.5 空间辨别学习记忆实验

  MG-3迷宫刺激器购自张家港市生物医学仪器厂。该仪器为三等分辐射式Y型,三臂相互夹角120°,每个臂长40 cm,宽15 cm,每臂顶端有刺激信号灯。有关技术指标:刺激频率2 Hz,刺激宽度125 ms,刺激强度30~50 V。大鼠在连续10次电击中有9次正确为训练成功,视为学会空间分辨。每天训练1次,连续训练1 w。在术后2、4、8、12、16 w用Y迷宫测定大鼠空间记忆能力,每天上午8点在暗室中进行,每只大鼠每天检测一次,连续5 d,取其平均值作为Y迷宫实测成绩。

  1.6 组织匀浆的制备

  各组大鼠在各时间用5%氯胺酮注射液(0.2 ml/100 g)腹腔注射麻醉后,快速断头取脑。取各组海马、额叶皮质组织块0.120 g在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,放入5 ml的小烧杯内。用移液管量取预冷的匀浆介质(pH 7.4、0.86%生理盐水)匀浆介质或者生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用移液管取总量的三分之二的生理盐水于烧杯中,将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,将制备好的10%匀浆用普通离心机3 000 r/min左右离心10~15 min。将离心好的匀浆留上清弃下面沉淀。

  1.7 MDA含量测定

  取10%的海马组织匀浆0.1 ml按试剂盒上的规范操作进行MDA测定,得出吸光度值进行计算。公式如下:组织MDA含量(nmol/mgprot):(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度÷蛋白含量。

  1.8 SOD活性检测

  SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法:取1%海马组织匀浆50 μl,按试剂盒上的操作进行SOD活性检测。

  1.9 统计学处理

  数据均以x±s表示,应用SPSS12.0软件进行统计分析,首先进行正态分布检验及方差齐性检验,各组间比较用单因素方差分析。两组间比较应用q检验。

  2 结 果

  2.1 慢性脑缺血大鼠动物模型评定

  脑缺血模型组手术1 d的死亡率为35%,正常对照组为0。脑缺血1 d,症状评分较正常对照组明显增高,手术后3 d脑缺血模型组死亡率为38.9%,正常对照组为0。7 d后神经病学及脑卒中指数指标均接近正常,但脑缺血模型组较差。术后2 w脑卒中指数与神经病学症状均为0~3分之间(见表1)。

  2.2 慢性脑缺血大鼠额叶皮质及海马区MDA的表达

  正常对照组额叶皮质与海马区均有少量MDA表达,脑缺血模型组及药物组缺血4 w MDA表达明显增高(P<0.01),呈一高峰状态,以后逐渐下降;各组脑缺血12 w时表达基本恢复正常,各组差异无统计学意义(P>0.05);脑缺血模型组缺血8 w时额叶皮质及海马区MDA的表达仍高于正常对照组(P<0.01),而依达拉奉组和脑蛋白水解物组8 w时额叶皮质及海马区MDA的表达虽较正常对照组高(P<0.05),但与脑缺血模型组比较,呈现显著性降低(P<0.01);依达拉奉组额叶皮质与海马区MDA表达在缺血4~8 w明显高于脑蛋白水解物组(P<0.05,P<0.01)。见表2。表1 大鼠脑卒中指数、神经病学评分表2 各组大鼠额叶皮质及海马区MDA的检测值

  2.3 各实验组SOD表达

  正常对照组额叶皮质与海马区SOD表达呈阳性;脑缺血模型组和药物组缺血4 w表达明显减少(P<0.01),呈一低峰,以后逐渐增加;各组脑缺血16 w时SOD表达基本恢复正常,与正常对照组相比较无统计学差异(P>0.05);脑缺血模型组缺血12 w额叶皮质及海马区SOD表达仍明显低于正常对照组(P<0.01);依达拉奉组缺血8 w额叶皮质及海马区SOD表达低于正常对照组(P<0.01);脑蛋白水解物组缺血12 w额叶皮质及海马区SOD表达仍低于正常对照组(P<0.05);依达拉奉组和脑蛋白水解物组在缺血12 w时各区SOD表达均高于脑缺血模型组(P<0.01);且依达拉奉组缺血8~12 w额叶皮质及海马区SOD表达均高于脑蛋白水解物组(P<0.01,P<0.05)。见表3。表3 各实验组大鼠额叶皮质、海马区SOD的表达

  3 讨 论

  依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑咻-5-酮,MCI-186)分子量为174.20的亲脂性基团,血脑屏障的通透率为60%,静脉给药后可清除脑内的具有高度细胞毒性的羟基基团。具有抑制黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤氧化酶的活性,刺激前列环素的生成,减少炎症介质白细胞三烯的生成,降低羟自由基的浓度,缩小缺血半暗带发展成梗死的体积,并抑制迟发性神经元死亡,延长治疗时间窗,改善神经功能。主要作用机制如下〔1~3〕:①抑制缺血后血管内皮细胞的损害(脑血管的内皮细胞、神经细胞):牛大动脉血管内皮细胞的培养液中,加入花生四烯酸过氧化物15-HPETE可引起细胞氧化损害。依达拉奉能抑制这种细胞损害,且其作用呈浓度依赖性,与对照组相比可抑制57%的细胞死亡。另外能够增加内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达。②缩小梗死体积:抑制缺血后脑水肿,调节花生四烯酸代谢,抑制迟发性神经元死亡,抑制线粒体通透转换孔(PTP)的开放和细胞损伤。调节脑缺血后单胺类物质代谢。③清除自由基和抑制脂质过氧化:有研究表明依达拉奉作为一种强有力的自由基清除剂可以明显上调脑缺血后脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1阳性细胞的数量,增加血中SOD含量、SOD通过歧化清除O-2阻断自由基病理性连锁反应,避免活性氧的毒性作用。减轻氧自由基对神经元的损伤,加强DNA的修复作用,增加脑组织对缺血的抗损伤能力,达到神经保护作用。

  本实验表明,依达拉奉和脑蛋白水解物有清除自由基的作用。但依达拉奉组较脑蛋白水解物组更能使SOD的产生增多,从而增强抗自由基的作用。

  自由基可引起生物膜不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应,在中枢神经系统含有丰富的不饱和脂肪酸,更易发生脂质过氧化反应,并形成大量脂质过氧化物,过氧化脂质增加可使细胞溶解,线粒体功能下降使血小板膜损伤,促使血小板在血管内皮细胞和内膜表面聚集黏着,加重组织的损伤。MDA是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用,是生物膜不饱和脂肪酸过氧化反应的代谢产物。MDA的含量可以反映体内脂质过氧化的程度并间接反映引起脂质过氧化的氧自由基水平。因此,通过测定组织内MDA含量可以估价组织中氧自由基水平和脂质过氧化反应的强弱。依达拉奉通过抗脂质过氧化,清除自由基起到细胞保护作用。另外依达拉奉还能抑制大鼠脑组织匀浆及线粒体匀浆中的铁依赖的过氧化反应破坏线粒体膜减轻大鼠半球栓塞模型的血脑屏障及能量代谢的功能紊乱〔5〕。可上调脑缺血后脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子Ⅰ阳性细胞的数量,减轻氧自由基对神经元的损伤,加强DNA的修复作用,增加脑组织对缺血区的抗损伤能力。本实验表明,依达拉奉和脑蛋白水解物药物均有降低MDA的含量,拟达到清除自由基作用,但依达拉奉较脑蛋白水解物清除自由基作用更显著。

【参考文献】
    1 Edatavone Acute Infarction Study Group.Effect of a novel free radical,scavanger,cdararone(MCI-186),on acute brain infarction.Randomized,placebo-controlled,double-bind study at multicenter〔J〕.Cerebrovasc Dis,2003;15(3):222-9.

  2 顾学兰,丁新生,狄 晴.依达拉奉注射液治疗急性脑梗死的临床疗效评价〔J〕.中国新药与临床杂志,2005;24(12):113-6.

  3 Tanakat M.Pharmacological and Clinical profile of the free radical scavanger adaravone as a neuroprtective agant〔J〕.Nippon Yakurigku Znli,2002;119(5):301-8.

  4 Bradeley LD. Complications in hysteroscopy:prevention,treatment and legal risk 〔J〕.Curr Opin Obrtet Cynecol,2002;14(4):409-15.

  5 Tomatsuri N,Yoshida N,Takagi T,et al.Edaromea newly developed radical scavanger,protect against isehemia reperfusion injury of the samll intestinein rats〔J〕.Int J Mol Med,2004;13(1):105-9.

  (编辑 曲 萌/曹梦园)

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