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HIP1基因沉默对HeLa细胞内吞的影响

首席医学网      2012年07月22日 14:09:34 Sunday  
 
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作者:徐 冶 李质馨 曹慧玲1 王弘珺 田洪艳 刘师兵1 于 洋1 朱辛为     作者单位:1 吉林医药学院医学科研实验室 (吉林医药学院组织胚胎学教研室,吉林 吉林 132013)

【摘要】  目的 探讨HIP1沉默后对HeLa细胞内吞的影响。方法 转染si-HIP1重组质粒到HeLa细胞中;Western印迹方法检测转染si-HIP1重组质粒的HeLa细胞中HIP1、表皮生长因子受体(EGFR)和AP2蛋白表达情况;激光共聚焦显微镜检测不同时间HeLa细胞EGF内吞情况。结果 转染si-HIP1重组质粒能有效抑制HeLa细胞HIP1蛋白表达,细胞内EGFR和AP2蛋白表达降低,同时减慢EGF在细胞中内吞和降解速度。结论 HIP1通过降低EGFR和AP2表达影响HeLa细胞对EGF的内吞。

【关键词】  HIP1;RNA干扰;内吞

  亨廷顿舞蹈病相互作用蛋白1(HIP1)是一个具有多结构域的癌蛋白,参与网格蛋白介导的内吞作用〔1〕。HIP1在几种原发性上皮肿瘤中高表达,包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌等〔2〕。对于HIP1在细胞内吞和受体运输方面的功能,以及这种作用的改变与肿瘤发生发展的关系还不清楚。本研究观察HIP1对HeLa细胞表皮生长因子(EGF)内吞和胞内运输的影响。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  重组干扰质粒si-HIP1,E.coli DH5α,HeLa细胞(吉林大学白求恩医学院病理生理学系);Trizol,Lipofectamine 2000(Invitrogen);质粒小抽试剂盒(Takara);细胞裂解液(Roche);HIP1,EGFR,AP2,β-肌动蛋白(β-actin)抗体(Santa Cruz);Alexa Fluor 647- EGF(Sigma),其他试剂为进口或国产分析纯。

  1.2 细胞培养及转染

  HeLa细胞培养于IMEM培养液,加入10%的小牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素。细胞于37℃,5%CO2培养箱内培养。将1×106 HeLa细胞接种于100 ml培养瓶中,细胞密度达80%~90%时,用无血清培养液洗3遍,用1 μg重组质粒si-HIP1:5 μl Lipofectamine 2000按说明转染细胞。转染4 h后弃上清,加入含10%小牛血清IMEM培养液继续培养48 h,收集细胞备用。

  1.3 Western印迹

  用细胞裂解液提取细胞总蛋白,Bio-rad法进行蛋白定量。取60 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳,将蛋白转移至PVDF膜上,用5%的脱脂奶粉封闭膜上的非特异结合位点。分别加入HIP1、EGFR、AP2和β-actin抗体(1∶200稀释),4℃孵育过夜,TBST洗涤3次,再加入HRP标记二抗(1∶1 000稀释),室温孵育1 h,TBST洗涤3次。DAB显色,凝胶成像系统采集图像后进行灰度值分析。

  1.4 EGF内吞分析

  将细胞在37℃饥饿无血清条件下培养4 h;用含有1 μg/ml Alexa Fluor 647-EGF的无血清DMEM孵育1 h;弃培养基,换成37℃预温的无血清培养基,在37℃条件下分别孵育0、10、30、60和90 min;然后快速用低pH缓冲液(2.5 mmol/L KCl,135 mmol/L NaCl,50 mmol/L CH3COOH,pH4.5)和磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液依次洗涤,4%多聚甲醛固定,PBS缓冲液洗涤后,激光共聚焦显微镜观察取图。

  1.5 统计学方法

  应用SPSS16.0统计软件,数据以x±s表示,单变量配对资料之间的比较采用配对样本t检验。

  2 结 果

  图1 EGFP标记重组质粒转染HeLa细胞2.1 转染效率观察 转染后48 h在激光共聚焦显微镜下观察,可见细胞内有较强的绿色荧光蛋白〔表皮生长因子受体(EGFR)〕表达,说明转染获得成功,si-scramble组表达的绿色荧光略多于si-HIP1组,分别为(80.2±4.5)%、(76.5±2.6)%。见图1。

  2.2 抑制HIP1表达对HeLa细胞EGF内吞的影响

  0 min,EGF集中在细胞膜表面;10 min,部分EGF被内吞到细胞内;与对照组相比,30、60 min,si-HIP1组细胞内的EGF荧光明显弱;与对照组相比,90 min,si-HIP1组细胞内的EGF荧光增强。见图2。

  2.3 si-HIP1对HeLa细胞中HIP1、EGFR和AP2表达的影响

  与对照组相比,si-HIP1组HeLa细胞中HIP1蛋白表达明显下降(87.5±4.1)%(P<0.05,n=3);EGFR和AP2蛋白表达分别降低(64.5±3.7)%、(75.3±2.5)%(P<0.05,n=3)。见图3。 图2 沉默HIP1基因后HeLa细胞EGF内吞变化图3 转染前后HeLa细胞中HIP1、EGFR和  AP2蛋白的表达

  3 讨 论

  临床上发现,EGFR信号途径在许多肿瘤中均可见其强度异常活化,早期的研究集中于肿瘤细胞表面受体数量的增加和受体的变异体的发现,这些不同类型的EGFR信号异常活化均与肿瘤的发生发展和恶性程度相关〔3〕。近年来发现,内吞异常与肿瘤发生有密切联系〔4〕,HIP1可能以稳定受体酪氨酸激酶信号而改变细胞的生长和存活〔1〕。临床资料显示在多种肿瘤中都可见到EGFR和HIP1共同的高表达,并且HIP1高表达与肿瘤恶性进展及不良预后呈正相关〔5,6〕。根据这类患者的临床表型,结合文献资料,可见HIP1影响EGFR信号,但HIP1表达增高和EGFR过度表达之间的具体作用机制还没有被阐明,可能的机制是HIP1加速EGFR的内吞与再循环,导致膜上受体数量的增加。HIP1有AP2和clathrin重链的结合位点,直接与内吞相关蛋白发生作用〔7〕。HIP1与AP2可以相互作用,说明HIP1参与细胞膜受体的内吞和再循环。本研究结果说明HIP1参与EGFR及内吞蛋白AP2的表达调控。

  越来越多的研究发现内吞途径蛋白的改变与肿瘤发生密切相关,关于内吞途径调节缺陷在肿瘤中作用的研究相对较少。利用激光共聚焦显微镜分别在不同的时间点监控细胞对荧光标记EGF的内吞。本结果说明HIP1在EGF内吞过程中及囊泡运输方面起着重要作用,为深入研究HIP1在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。

【参考文献】
    1 Hyun TS,Rao DS,Saint-Dic D,et al.HIP1 and HIP1r stabilize receptor tyrosine kinases and bind 3-phosphoinositides via epsin N-terminal homology domains〔J〕.J Biol Chem,2004;279(14):14294-306.

  2 Rao DS,Bradley SV,Kumar PD,et al.Altered receptor trafficking in Huntingtin Interacting Protein 1-transformed cells〔J〕.Cancer Cell,2003;3(5):471-82.

  3 Mendelsohn J,Baselga J.The EGF receptor family as targets for cancer therapy〔J〕.Oncogene,2000;19(56):6550-65.

  4 Polo S,Pece S,Di Fiore PP.Endocytosis and cancer〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2004;16(2):156-61.

  5 Rao DS,Hyun TS,Kumar PD,et al.Huntingtin-interacting protein 1 is overexpressed in prostate and colon cancer and is critical for cellular survival〔J〕.J Clin Invest,2002;110(3):351-60.

  6 Bradley SV,Holland EC,Liu GY,et al.Huntingtin interacting protein 1 is a novel brain tumor marker that associates with epidermal growth factor receptor〔J〕.Cancer Res,2007;67(8):3609-15.

  7 Metzler M,Legendre-Guillemin V,Gan L,et al.HIP1 functions in clathrin-mediated endocytosis through binding to clathrin and adaptor protein 2〔J〕.J Biol Chem,2001;276(42):39271-6.

  (编辑 袁左鸣/张 慧)

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