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五脉绿绒蒿总黄酮及其中苜蓿素的体外抗氧化活性

首席医学网      2012年07月22日 14:02:42 Sunday  
 
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作者:王志旺 张 扬 程 芳 郭 玫 马 骏    作者单位:(甘肃中医学院,甘肃 兰州 730000)

【摘要】  目的 研究五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素的体外抗氧化作用。方法 采用体外实验研究五脉绿绒蒿总黄酮与不同剂量苜蓿素的化学抗氧化作用(包括对羟基自由基和超氧阴离子的清除作用)以及动物组织抗氧化作用(包括对大鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用和对H2O2诱导的红细胞氧化溶血的保护作用)。结果 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素可清除羟基自由基与超氧阴离子;抑制大鼠肝匀浆自发性与VitC-Fe2+诱导性脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的生成;减少H2O2诱导的红细胞氧化溶血。结论 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素具有清除自由基及抗脂质过氧化的作用。

【关键词】  五脉绿绒蒿总黄酮;苜蓿素;抗氧化;自由基

  【Abstract】 Objective To study on anti-oxidative activity of total flavones of radix angelicae sinensis and tricin in vitro. Methods Anti-oxidative activities of chemistry (oxygen radicals) and of mammal fabric (rat liver and red blood cells) were adopted to observe the ant-oxidative effects of total flavones of radix angelicae sinensis and tricin in vitro. Results Total flavones of radix angelicae sinensis and tricin exhibited an inhibitory effect on the hydroxyl free radical and superoxide an ion free radical showing antioxidant activity in homogenates of the rat liver. The haemolysis of rat red blood cells on H2O2-induced was blocked by total flavones of radix angelicae sinensis and tricin (P<0.05). Conclusions Total flavones of radix angelicae sinensis and tricin show antioxidant activity in experiments in vitro.

  【Key words】 Total flavones of radix angelicae sinensis;Tricin;Anti-oxidative activity in vitro;Free radicals

  罂粟科绿绒蒿属植物是藏医传统用药,具有清热解毒、止痛利尿等功效,临床用于治疗头痛、肝炎、肺炎、水肿等病症〔1〕,而藏医药以五脉绿绒蒿为其正品,在30多个藏药复方中配伍使用。本课题组前期研究显示五脉绿绒蒿总黄酮具有明显的抗炎、镇痛等作用〔2〕。为进一步研究五脉绿绒蒿的药理作用机制,本实验分别设计了五脉绿绒蒿总黄酮及其中指标性成分苜蓿素的化学抗氧化与动物组织体外抗氧化实验,以验证五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素的抗氧化功能。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料

  Wistar大鼠,雄性,体重(200±20)g,由甘肃中医学院SPF级动物实验中心提供,实验动物质量合格证SCXK(甘)2004-0006;三氯乙酸(TCA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)、硫酸亚铁、过氧化氢等均为市售分析纯试剂;VIS7220型分光光度计(北京第二光学分析仪器厂)、BS110S型Sartorius电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)、DZKW电子恒温水浴锅(北京永光明医疗仪器厂)、低温离心机(北京医用离心机厂)。

  1.2 实验方法

  1.2.1 五脉绿绒蒿总黄酮及苜蓿素的制备

  称取藏药五脉绿绒蒿药材粗粉适量,用95%乙醇回流提取,减压回收乙醇后加入石油醚以除去脂溶性较强的杂质,残留物用1 mol/L HCl溶液溶解,调pH值至2~3,过滤,残留物部分即为黄酮类粗品。将上述黄酮粗品用1 mol/L NaOH溶液溶解,调pH值至9~10,过滤,碱水层再用1 mol/L HCl溶液调pH值至2~3,用乙酸乙酯萃取数次,合并乙酸乙酯,减压浓缩即得五脉绿绒蒿总黄酮。将上述所得五脉绿绒蒿总黄酮上硅胶柱,氯仿-丙酮(10∶1)洗脱流分分别用石油醚-乙酸乙酯(2∶1)进行硅胶柱层析和氯仿-甲醇(1∶1)进行聚酰胺柱层析,得一化合物,经ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR和DEPT图谱数据分析确定该化合物为苜蓿素。精密称取上述五脉绿绒蒿总黄酮100.0 mg、苜蓿素10.0 mg,分别用少量乙醇溶解,加双蒸水稀释、定容至100 ml,即得1.0 mg/ml五脉绿绒蒿总黄酮溶液和100 μg/ml苜蓿素溶液,冷藏备用。

  1.2.2 样品的制备

  1.2.2.1 肝匀浆制备

  大鼠禁食12 h后,脱颈椎致死,迅速取出肝脏,4℃生理盐水中反复漂洗,洗净表面残血并剔除脂肪及结缔组织,滤纸吸干多余水分,称重,用pH 7.4的9倍量冷生理盐水制成10%的肝匀浆,4℃冷藏待用。

  1.2.2.2 红细胞悬浮液的制备

  大鼠眼眶取血,肝素抗凝后4℃ 3 000 r/min离心10 min,移弃上清液,用生理盐水洗涤沉淀红细胞3次,制成0.5%红细胞悬液,置4℃冰箱保存待用。

  1.2.3 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对·OH清除效果的测定

  根据Smirnoff的方法改进〔3〕。4 ml反应体系(1 mmoL/L FeSO4、9 mmoL/L水杨酸和113.34 mmoL/L H2O2各1.0 ml)中包括1.0 ml五脉绿绒蒿总黄酮或不同浓度的苜蓿素在37℃反应30 min,紫外分光光度计测定510 nm处OD值。其中空白反应管以双蒸水代替药液、空白对照管以双蒸水代替药液和FeSO4、给药对照管以双蒸水代替FeSO4进行实验。

  1.2.4 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对超氧阴离子清除效果的测定〔4〕

  采用改进的邻苯三酚法,即在碱性条件下邻苯三酚可以自氧化而产生超氧阴离子自由基,并生成有色中间产物,在325 nm处有最大吸收峰。实验中每支试管加Tris-HCl缓冲液(pH8.2) 4.5 ml,25℃预热20 min,加1.0 ml五脉绿绒蒿总黄酮或不同浓度的苜蓿素溶液,再加1 mmol/L的邻苯三酚0.4 ml,立即摇匀,准确反应4 min后立即加入8 mol/L HCl 0.1 ml终止反应,325 nm测吸光值。其中空白反应管以双蒸水代替药液、空白对照管以双蒸水代替药液和邻苯三酚、给药对照管以双蒸水代替邻苯三酚进行实验。

  1.2.5 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的影响〔5,6〕

  取1.2.2.1项下10%肝匀浆1.0 ml于试管中,各加入1.0 ml五脉绿绒蒿总黄酮或不同浓度苜蓿素溶液,在37℃水浴恒温振荡1.5 h,取出后加入10% TCA 2.0 ml终止反应,5 min后加入0.67%TBA 1.0 ml,振荡混匀,沸水浴中显色15 min,流水冷却,经3 500 r/min离心5 min除去沉淀,取上清液在532 nm处测定吸光度(OD),其中对照管以双蒸水代替药液,底色管以双蒸水代替TBA进行实验。

  1.2.6 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对VitC-Fe2+诱导的大鼠肝匀浆脂质过氧化的影响〔5,6

  〕 取1.2.2.1项下10%肝匀浆1.0 ml于试管中,各加入1.0 ml五脉绿绒蒿总黄酮或不同浓度的苜蓿素溶液、VitC (1 mmol/L) 0.05 ml及FeSO4·7H2O (1 mmol/L) 0.05 ml,其余操作和计算方法与1.2.5项下相同。

  1.2.7 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对大鼠红细胞氧化溶血的影响〔7〕

  取1.2.2.2项下0.5%红细胞悬液1.0 ml,加入1.0 ml五脉绿绒蒿总黄酮或不同浓度的苜蓿素(用生理盐水配制),最后加50 mmol/L H2O2 0.5 ml混匀,37℃温浴1 h,加生理盐水2.5 ml,3 000 r/min离心5 min,取上清于415 nm测定其吸光值(OD)。其中空白反应管以生理盐水代替药液、空白对照管以生理盐水代替药液与H2O2、给药对照管以生理盐水代替H2O2进行实验。以空白管为100%溶血来计算溶血度。

  1.3 统计学分析

  实验数据用x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,应用SPSS11.5统计软件进行统计处理。

  2 结 果

  2.1 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对·OH清除效果的测定

  表1结果显示,五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素能显著清除Fenton反应体系中产生的·OH(P<0.05),且苜蓿素不同剂量组(3.1~25.0 μg/ml)清除作用呈一定的量效关系,最大清除率为17.4%。表1 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对·OH清除效果的测定

  2.2 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对超氧阴离子清除效果的测定

  五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对超氧阴离子的清除有显著的加速作用(P<0.01),1.7~13.3 μg/ml浓度范围的苜蓿素对超氧阴离子的清除有一定的量效关系(表2)。表2 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对超氧阴离子清除效果的测定

  2.3 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响

  由于MDA是脂质过氧化的主要产物,其含量是衡量脂质过氧化程度的一个重要指标。由表3可以看出,五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对肝匀浆自发性脂质过氧化物MDA的生成有一定的抑制作用,与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。表3 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对大鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响

  2.4 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对VitC-Fe2+诱导的大鼠肝匀浆脂质过氧化的影响

  由表4可以看出,五脉绿绒蒿总黄酮及苜蓿素能明显抑制VitC-Fe2+诱导的肝匀浆脂质过氧化产物MDA的生成(P<0.05);随着反应体系中苜蓿素浓度的增加(12.5~100 μg/ml),对肝匀浆诱导性氧化的抑制作用增强且存在一定的量效关系。 表4 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对VitC-Fe2+诱导的大鼠肝匀浆脂质过氧化的影响

  2.5 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对大鼠红细胞氧化溶血的影响

  H2O2为强氧化剂,因破坏红细胞膜而导致溶血,本实验观察了五脉绿绒蒿总黄酮与苜蓿素对H2O2诱导的红细胞氧化溶血的影响,表5结果显示五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对H2O2诱导的红细胞溶血具有明显的抑制效果(P<0.05),苜蓿素不同剂量组(0.15~1.20 μg/ml)的抑制作用呈现一定的量效关系。表5 五脉绿绒蒿总黄酮和苜蓿素对大鼠红细胞氧化溶血的影响

  3 讨 论

  自由基参与机体多种生理病理过程,从疾病谱来看,机体自由基水平过高是多种疾病特别是老年性疾病的主要病理之一,因此,医药界一直在不断探索保护生物膜与生物大分子的途径、利用抗氧化剂来清除活性自由基,阻止自由基对机体的氧化损伤,而作为天然抗氧化剂的黄酮类化合物是该领域的研究热点〔8〕。藏药五脉绿绒蒿是藏医治疗肝炎、肺炎等多种炎症性疾病的常用药,前期研究结果显示五脉绿绒蒿总黄酮具有明显的抗炎、保肝作用〔2,9〕。本实验探讨了五脉绿绒蒿总黄酮及其指标性成分苜蓿素对化学氧化体系和体外生物组织氧化体系的影响,实验数据表明五脉绿绒蒿总黄酮与不同剂量的苜蓿素可清除羟基自由基与超氧阴离子、抑制肝组织MDA的生成、抵抗红细胞的氧化溶血。实验结果显示五脉绿绒蒿总黄酮与苜蓿素具有清除自由基以及抗脂质过氧化的作用,本实验为进一步研究防治与自由基有关疾病的药物提供了实验依据。

【参考文献】
    1 杨永昌.藏药志〔M〕.西宁:青海人民出版社,1991:465-6.

  2 王志旺,郭 枚,马 骏,等.五脉绿绒蒿抗炎镇痛作用有效部位的研究〔J〕.中国中医药信息杂志,2010;17(1):21-2.

  3 SMIRNOFF N,CUMBES Q.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes〔J〕.Phytochemistry,1989;2(4):1057-60.

  4 王书芳,王 勤,潘 静.吡咯啉氮氧自由基及衍生物抗大鼠不同组织脂质过氧化损伤〔J〕.中国药理学通报,2001;17(4):424-7.

  5 赵文红,邓泽元,范青生,等.淫羊藿总黄酮体外抗氧化实验〔J〕.南昌大学学报(理科版),2009;33(1):53-5.

  6 刘宝剑,郭延生,曲亚玲,等.红车轴草总黄酮体外抗氧化作用的研究〔J〕.中国药学杂志,2009;44(16):1234-7.

  7 周 娟,吴 宏,刘 青,等.海带多糖的体外抗氧化活性研究〔J〕.广东药学院学报,2009;25(4):397-400.

  8 苏 锐,张 红.马齿苋黄酮抗氧化活性研究〔J〕.安徽农业科学,2010;38(8):4068-70.

  9 丁 莉,李锦萍.藏药五脉绿绒蒿对小白鼠实验性肝损伤保护作用的研究〔J〕.青海畜牧兽医杂志,2007;37(4):7-8.

  (编辑 曹梦园)

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