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γ-氨基丁酸及B受体在胃癌SGC-7901细胞中表达及对细胞迁移能力的影响

首席医学网      2012年07月22日 14:04:26 Sunday  
 
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作者:史良会1 张才全    作者单位:1 皖南医学院附属弋矶山医院胃肠外科 (重庆医科大学第一附属医院胃肠外科,重庆 400016)

【摘要】  目的 观察GABA,GAD65,GABABR1在胃癌SGC-7901细胞中的表达及对细胞迁移能力的影响。方法 RT-PCR、IF及Western印迹检测胃癌细胞SGC-7901中GABA、GAD65及GABABR1 mRNA及蛋白表达;不同浓度GABA,Baclofen及CGP35348作用于胃癌细胞SGC-7901细胞24 h,transwell细胞迁移小室检测细胞迁移能力的变化。结果 GAD65,GABABR1 mRNA及蛋白表达于SGC-7901细胞中;GABA,GABABR1及GAD65蛋白定位于SGC-7901细胞胞膜、胞质;与空白组比较,随着GABA浓度的增加,细胞迁移能力增强;5 μmol/L及50 μmol/L baclofen作用后,亦可促进细胞迁移;而随着CGP35348浓度的增加,细胞穿膜数量减少(P<0.01)。5 μmol/L baclofen对细胞的迁移促进作用可被100 μmol/L的CGP35348逆转。结论 GABA及其B受体在SGC-7901细胞中的高表达可促进细胞迁移。

【关键词】  胃癌;γ-氨基丁酸;迁移

  【Abstract】 Objective To investigate the expressions of GABA, GAD65 and GABABR1 in SGC-7901 cells and the effects of cell migration. Methods RT-PCR, IF and Western blot were used to detect the expressions of GABA, GAD65 and GABABR1 in gastric cancer cells SGC-7901. SGC-7901 cells were cultured in transwell chamer for 24 h with different concentrations of GABA, baclofen and CGP35348. The number of cells which migrated through micropores and stayed on the outer bottom side of insert systems were observed and counted. Results The mRNA and protein expressions of GABA, GAD65 and GABRP in SGC-7901 cells were significantly higher than those in normal gastric mucosa (P<0.01). GABA, GAD65 and GABRP protein levels were predominantly localized on the cell membrane and cell cytoplasm of SGC-7901. Compared with that of blank group, the migration capability of SGC-7901 was obviously increased by the higher concentration of GABA and 5, 50 μmol/L Baclofen, but significantly inhibited by 5, 50 μmol/L Bicuculline (P<0.01).The effect of 5 μmol/L Baclofen was blocked by pretreatment with 100 μmol/L CGP35348. Conclusions Higher expressions of GABA and GABRP in SGC-7901 cells may promote cell migration.

  【Key words】 Gastric cancer; γ- aminobutyric acid; Migration

  γ-氨基丁酸(GABA)最初被鉴定为成年哺乳动物大脑中最主要的神经递质抑制剂,在中枢神经系统中含量丰富,现已明确GABA及其受体出现在许多外周组织。在人及啮齿动物中,GABA参与调节细胞分裂,分化及成熟〔1,2〕。在胃癌中,GABA B型受体〔gamma-aminobutyricacid(GABA)B receptor〕及其合成酶L-谷氨酸脱羧酶(GAD)含量显著增加〔3~5〕。学者们提出,GABA还可作为胃肠激素,调节哺乳动物胃肠道肿瘤的发展。但GABA参与胃肠道肿瘤的发生发展的调节机制尚属未知。本文通过以胃癌细胞株(SGC-7901)为模型,探讨了在胃癌细胞中,GABA及其B受体(GABABR)的表达及其对细胞迁移能力的影响,为进一步明确GABA在胃肠道肿瘤发生发展中的机制补充资料。

  1 材料与方法

  1.1 主要材料和试剂

  人胃腺癌细胞株SGC-7901购自中科院上海细胞库。正常脑组织取自脑外伤后早期清创术,并获得患者知情同意书,整个实验过程遵循医学伦理学的原则。RT-PCR试剂盒购于Promega公司,兔多抗GABA,GAD65抗体购自武汉博士德生物工程有限公司,兔多抗GABABR抗体购自Abcam,异硫氰酸荧光素(FITC)兔抗羊二抗购自北京中山生物技术有限公司, transwell小室购自BD公司,GABA、GABABR激动剂baclofen、GABABR拮抗剂CGP35348均购自Sigma,Western印迹相关试剂购自碧云天公司。

  1.2 引物设计与合成

  根据GenBank发布的GABA-B1R,GAD65,磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)编码区序列,采用PrimerPremier5.0设计引物,Blast同源性比较后,送于上海生工合成。GABABR1,BC050532.1,上游引物:5′CCTCATTGGGTGGTATGCT3′,下游引物:5′TTCAGTCGCTTGGTTAGTTTC3′,扩增产物为195 bp。GAD65,M81882.1,上游引物:5′CCTCCTACCTCTTTCAGCA3′,下游引物:5′TTCCCATCAAACACCATCT3′,扩增产物为226 bp;GAPDH,NM_002046.3,上游引物:5′TGAAGGTCGGAGTCAACGG3′,下游引物:5′TGGAAGATGGTGATGGGAT3′,扩增产物为223 bp。

  1.3 细胞培养

  SGC-7901胃癌细胞培养于1640培养基,10%胎牛血清(BSA)。于37℃、5% CO2培养箱中培养,每1~2 d传代1次。

  1.4 免疫荧光检测

  将无菌盖玻片铺于6孔细胞培养板中,取对数生长期的细胞传代至6孔细胞培养板,贴壁后,取出玻片,按免疫荧光常规步骤操作。一抗以1:200稀释,以正常兔血清IgG代替一抗为阴性对照。结果采用激光共聚焦显微镜扫描成像。

  1.5 RT-PCR检测

  按照细胞及组织总RNA试剂盒提取步骤提取总RNA,随后进行两步法实施RT-PCR。反应条件为:94℃预变性2 min,94℃30 s,53℃~55℃,30 s,72℃ 1 min,25个循环,72℃延伸10 min。所得产物经2%琼脂糖凝胶电泳,BIO-RAD凝胶成像仪扫描分析。内参选择β-肌动蛋白(β-actin),用BIO-RAD图像分析软件对条带灰度值进行半定量分析。

  1.6 Western检测

  将生长至90%以上密度的细胞经预冷磷酸盐缓冲液(PSB)洗涤,按照总蛋白提取试剂盒步骤提取。4℃ 12 000 r/min离心5 min,吸取上清液,采用BSA测定蛋白浓度后,实施十二烷基磷酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),将凝胶半干转于聚氟丙烯(PVDF)膜,10%Tris盐酸缓冲液(TBST)室温封闭1~2 h,一抗4℃孵育过夜,加入羊抗兔二抗,室温孵育1 h,增强化学发光法(ECL)显色,拍照。以GAPDH为内参,用BIO-RAD图像分析软件对条带灰度值进行定量分析。

  1.7 细胞迁移实验

  Transwell小室加入50 μl无血清1640培养基置于37℃孵育30 min。取对数生长期的细胞,用含BSA的无血清培养基重悬,调整细胞密度为1×109/L接种于上室,并加入含不同浓度的GABA(0,1,10,100 μmol/L),GABABR激动剂(0.5,5,50 μmol/L)、GABABR拮抗剂(1,10,100 μmol/L),激动剂+拮抗剂(5 μmol/L+100 μmol/L)培养基;下室为含10%BSA的1640培养基。37℃,5% CO2孵育24 h,取出聚碳酸酯膜,擦净膜上的未穿过的细胞,经甲醇固定15 min、常规苏木素-伊红(HE)染色,随机于200倍光镜下取上、下、左、右、中心5个视野,计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数,取每个视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力。

  1.8 统计学方法

  应用SPSS15.0统计软件进行分析,数据资料以x±s表示,进行单因素方差分析,两两比较用LSD法。

  2 结 果

  2.1 RT-PCR检测GAD65、GABABR1 mRNA在脑组织及SGC-7901细胞中表达

  电泳结果显示,在226 bp及195 bp处,脑组织及SGC-7901细胞中可见清楚条带,提示GABABR1,GAD65 mRNA表达于人胃癌细胞SGC-7901细胞中,脑组织结果为阳性对照组。见图1。

  2.2 免疫荧光定性检测GABABR1、GABA、GAD65蛋白在SGC-7901细胞中表达

  间接免疫荧光结果显示,GABABR1,GABA,GAD65明显表达于SGC-7901细胞胞膜及胞质,异硫氰酸荧光素(FITC)标记,激光共聚焦激发出绿色荧光,红色为聚酰亚胺(PI)染核。阴性对照未见阳性表达。见图2。

  2.3 Western印迹定量检测GAD65、GABABR1蛋白在SGC-7901细胞中表达

  人胃癌SGC-7901细胞中可见GABABR1及GAD65的表达,脑组织结果为阳性对照组(P<0.01)。见图3。

  2.4 Transwell细胞迁移实验检测不同浓度的GABA及GABAB激动剂、拮抗剂对SGC-7901细胞迁移能力的影响

  与空白对照组比较,随着GABA浓度的增加,细胞迁移能力增强,10 μmol/L GABA即可显著增强细胞迁移能力(P<0.05),5 μmol/L及50 μmol/L GABAB激动剂baclofen可显著增加细胞迁移数目(P<0.01)但二者之间差异不显著。随着GABABR拮抗剂CGP35348浓度的增加,其对细胞迁移能力的抑制作用逐渐加强。与空白组比较,10 μmol/L及100 μmol/L组,穿膜细胞数量显著下降(P<0.01)差异显著。同时发现, 5 μmol/L Baclofen作用于细胞后,采用100 μmol/L的CGP35348再次处理,可发现穿膜细胞数目与正常对照比较,差异不显著,提示了5 μmol/L Baclofen对细胞迁移的促进作用可被100 μmol/L的CGP35348逆转。见图4~图6。图1 RT-PCR检测脑组织及SGC-7901细胞中GABABR1,GAD65 mRNA的表达图2 免疫荧光检测GABA,GAD65,GABABR1在SGC-7901细胞中的表达(×200)图3 Western印迹检测SGC-7901细胞及脑组织中GAD65,GABABR1蛋白的表达1)P<0.05,2)P<0.01图4 不同GABA浓度对细胞迁移能力影响图5 不同浓度baclofen对细胞迁移能力影响1)P<0.05,2)P<0.01图6 不同浓度CGP35348,及CGP35348与baclofen联合应用后对细胞迁移能力的影响

  3 讨 论

  GABABR于1980年被Bowery等发现,被鉴定为代谢型受体超家族成员,为G蛋白耦联受体(GPCR),在中枢神经系统中,主要是参与介导慢的、持续较长的抑制性效应。随后,Kaupmann等〔6〕报道了其2种剪接异构体,即GBRla(GABABR1)和GBRlb(GABABR2),二者均有7个跨膜区结构。GABABR的完整功能实施需要是通过GBRla和GBRlb C末端超螺旋结构相互作用,组成异源二聚体。Calver等〔7〕的研究表明,GABABR mRNA在人的大多数外周组织中均有表达,但是在胃中表达相对较低。而随后的研究者发现,在胃癌组织中GABABR1及GABABR2蛋白的阳性表达明显增加,且二者的阳性分布相似。本文结果提示了,在胃癌细胞株SGC-7901细胞中,GABA,GABABR1,GAD65表达于细胞胞浆。

  功能性的B型受体的异二聚体中,B1亚单位对于配体的结合是必需的,而B2受体是B1受体发挥功能所必需的。B1亚单位表达于内质网中,只有当同时表达B2亚单位时,B1亚单位方可从内质网中转运至细胞表面,并与B2受体形成异二聚体,发挥作用〔8,9〕。因此,本文选择了以B1受体为代表,检测在SGC-7901细胞中,是否有其表达。结果发现,GABABR1在SGC-79-01细胞中蛋白定位于细胞胞膜胞质,提示了在SGC-7901细胞中,B型受体是以功能性受体形式出现的。

  Tatsuta及其团队是最早发现了GABA与肿瘤之间的关系〔10〕。研究发现,GABA及其类似物对肿瘤细胞的生长具有抑制或者是促进作用。GABABR的激动剂巴氯芬(Baclofen)可以显著的抑制卵巢癌细胞的生长,同时表明了代谢型的GABABR在肿瘤细胞中的表达及活化参与了肿瘤细胞的迁移〔11〕。而在肝癌细胞的体内、体内外研究中证实了,巴氯芬均可通过激活GABABR,从而有效抑制肝癌细胞的生长〔12〕。在前列腺癌细胞株C4-2中研究者发现,GABAB型受体激动剂可以通过增加基质金属蛋白酶(MMPs)的产量,从而提高细胞的侵袭力,而拮抗剂作用反,且经典的GABA的A型受体不会影响MMP的产量及细胞的侵袭力〔13〕。Tatsuta及其团队还指出,GABA可能以一种胃肠激素形式调节胃肠道肿瘤的发生。早期的文献研究报道了在大鼠中,GABA的B型受体拮抗剂可将胃癌的发生率及数量,在结肠癌细胞中,研究发现GABA通过B受体抑制结肠癌细胞迁移。Maemura等〔14〕人利用胃癌细胞株中的印戒细胞KAT III细胞研究了GABA及其受体在胃癌细胞中的作用机制,而出乎意料的是并未在该细胞株检测到B型受体的表达,采用GABA及其受体激动剂,拮抗剂干预后,发现细胞迁移,侵袭能力并没有受到影响。从而推测在胃癌中,B受体的表达可能对细胞的迁移,侵袭能力所必须。本文利用Transwell小室细胞迁移模型证实了GABA及其B受体的激动剂巴氯芬可显著提高SGC-7901细胞迁移能力,而拮抗剂CGP35248出现显著抑制作用。与空白组比较,所有实验组并未发现细胞的增殖能力改变。目前关于抑制性神经递质GABA与胃癌之间的联系及其临床应用价值尚有待进一步研究。

  总之,在人胃癌细胞株SGC-7901细胞中,GABA、GAD65及GABABR1呈现高表达,提示GABA可能以旁分泌或自分泌方式,并可能通过B受体促进SGC-7901细胞迁移,加速胃癌的发展过程。

【参考文献】
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  2 缪宇锋,汪芳裕,陈龙邦.γ-氨基丁酸及其受体与肿瘤增殖和侵袭的关系〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志,2009;16(1):93-6.

  3 朱人敏,秦苏堤,汪芳裕,等.人胃癌组织中γ-氨基丁酸含量及其受体和谷氨酸脱羧酶的表达〔J〕.中华消化杂志,2005;25(11):684-5.

  4 朱人敏,秦苏堤,汪芳裕,等.高效液相色谱法测定人胃黏膜中γ-氨基丁酸和谷氨酸含量〔J〕.世界华人消化杂志,2004;12(5):1210-2.

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  6 严 蓉,古 存,朱珊珊,等.B型γ-氨基丁酸受体及其应答机制〔J〕.国外医学·麻醉学与复苏分册,2005;26(1):33-5.

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  10 Tatsuta M,Lishi H,Baba M,et al.Inhibition by gamma-amino-n-butyric acid and baclofen of gastric carcinogenesis induced by N-methyl-N0-nitro-N-nitrosguanidine in Wistar rats〔J〕.Cancer Res,1990;50(16):4931-4.

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  12 Zhang M,Gong Y,Assy N,et al.Increased GABAergic activity inhibits alpha-fetoprotein mRNA expression and the proliferative activity of the HepG2 human hepatocellular carcinoma cell line〔J〕.J Hepatol,2000;32(1):85-91.

  13 Azuma H,Inamoto T,Sakamoto T,et al.γ-aminobutyric acid as a promoting factor of cancer metastasis,induction of matrix metalloproteinase production is potentially its underlying mechanism〔J〕.Cancer Research,2003;63(23):8090-6.

  14 Maemura K,Shiraishi N,Sakagami K,et al.Proliferative effects of gamma aminobutyric acid on the gastric cancer cell line are associated with extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation〔J〕.J Gastroenterol Hepatol,2009;24(4):688-96.

  (编辑 袁左鸣)

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