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siRNA 抑制人黑色素瘤A375细胞株VEGF 的表达及细胞增殖

首席医学网      2012年07月22日 14:07:03 Sunday  
 
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作者:李 春 刘海鹏 赵燕颖1 李然伟2 张 舵    作者单位:1 吉林大学第二医院泌尿外科 2 吉林大学第四医院消化内科 (吉林大学第一医院整形外科,吉林 长春 130021)

【摘要】  目的 研究小干扰RNA(siRNA)对人黑色素瘤A375细胞血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的抑制作用及对癌细胞增殖的抑制作用和诱导凋亡的作用。方法 设计并合成特异性靶向人VEGF基因的siRNA,通过脂质体转染到A375细胞中。RT-PCR检测siVEGF对VEGF基因表达的抑制作用;MTT法检测siVEGF对癌细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测siVEGF诱导细胞凋亡的作用。稳定转染的肿瘤细胞株接种于裸鼠皮下,观察肿瘤细胞成瘤情况。结果 转染siVEGF1和siVEGF2组VEGF mRNA表达水平与空白对照组比较分别下调了59.92%和69.63%,转染阴性对照质粒组VEGF基因表达水平都无明显改变。转染siVEGF1和siVEGF2的细胞增殖受到抑制,增殖抑制率具有时间依赖性,细胞的凋亡率分别为33.8%和41.1%。转染SiVEGF2的A375细胞成瘤率平均为66.7%和50%,而对照组成瘤率均为100%。结论 构建的siRNAVEGF能有效抑制人黑色素瘤A375细胞增殖及成瘤率,诱导其凋亡,其机制可能与其特异性有效下调VEGF基因的表达有关。

【关键词】  siRNA;血管内皮生长因子;黑色素瘤;RT-PCR;凋亡

  黑色素瘤是致死性最大的皮肤肿瘤,近年来其发病率呈明显上升趋势。然而目前对黑色素瘤的治疗仍缺乏高效、敏感药物,尽管顺铂和达巴卡嗪(氮烯咪胺,DTIC) 对黑色素瘤有效,但其有效率也仅为20%〔1〕,开发新药和改善治疗是目前急待解决的难题。血管生成是肿瘤生长和转移的关键步骤,血管内皮生长因子(VEGF) 是肿瘤血管生成过程中作用最强、特异性最高的促血管生长因子〔2〕。抑制肿瘤新生血管形成、阻断血供,导致肿瘤细胞坏死和阻断转移途径,已经成为治疗实体瘤的一种新途径〔3,4〕。本研究构建了靶向VEGF 的小干扰RNA(siRNA) 真核表达载体,抑制A375细胞VEGF的表达,探讨siVEGF对A375细胞增殖的影响,并探讨其作用机制,期望为黑色素瘤的治疗开辟一条新的途径。

  1 材料与方法

  1.1 试剂

  Silencer TM siRNA Const ruction Kit 购于 Ambion 公司;限制性内切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、T4 DNA 连接酶和RT-PCR 试剂盒均为大连 Ta KaRa 生物公司产品;柱离心式质粒抽提试剂盒、柱离心式胶回收试剂盒均购自美国Promega 公司;脂质体转染试剂、RNA 提取试剂Trizol 及DEPC 购自美国Roche 公司;IMDM 培养基及小牛血清购自美国Hyclone公司。

  1.2 方法

  1.2.1 真核表达载体PU6-VEGF-siRNA的构建

  基因库查找编码人VEGF序列,应用Ambion公司RNAi设计软件,根据设计原则〔5〕设计针对VEGF mRNA作用的公共靶点的siRNA,其发卡样两端配对siRNA寡核苷酸链,同时合成互补链,分别在5′和3′端引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 酶切位点(上海生工生物工程技术服务有限公司合成) 。二对互补并编码相应短发夹状的siRNA 寡核 苷酸链序列如下: 第1 对,5′-GAAGAGAAGGAAGAGGAGATTCAAGAGATCTCCTCTTCCTTCTCTTCTTTTTT-3′,5′-AATTAAAAAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGATCTCTTGAA  TCTCCTCTTCCTTCTCTTCGGCC-3′;第2 对,5′-CATCACCATGCAGATTATGTTCAAGAGACATAATCTGCATGGTGATGTTTTTT-3′,5′-AATTAAAAAACATCACCATGCAGATTATGTCTCTTGAAC  ATAATCTGCATGGTGATGGGCC-3′。用T4 DNA 连接酶将合成的寡核苷酸链插入 到PsilenceTM U6 2.1 线性载体。体外合成 siVEGF1 和siVEGF2,阴性对照空质粒购于 Ambion,与任何编码序列无同源性。重组体转化大肠杆菌Jm109,筛选Amp抗性克隆。提取质粒,双酶切及测序法鉴定重组质粒。

  1.2.2 细胞培养及转染

  人黑色素瘤A375细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。用含10%小牛血清的IMDM培养基,置于5%CO2培养箱中37℃培养。胰酶消化处于对数生长期的细胞,传代于孔板或培养瓶,在无抗生素的培养基中培养,采用脂质体转染试剂盒包裹经灭菌处理的重组质粒。转染前将对数生长期的人黑色素瘤A375细胞以每孔5×105/ml 的浓度接种于6孔培养板中,待细胞融合率达60% ~80%时分组转染: 空白对照组只加脂质体,阴性对照组转染阴性对照质粒,另外两组分别转染siVEGF1和siVEGF2。以50 nmol/L浓度进行转染,按说明操作,将重组质粒及阴性对照质粒-脂质体复合物转染至细胞中,只加转染试剂的A375细胞作为空白对照。转染后6~24 h换液,继续培养。

  1.2.3 实验动物

  裸鼠,雌雄各半,4~6周龄,质量20~26 g,购于北京中国医学科学院实验动物研究所,并在25℃~37℃无菌恒温、恒湿(45%~50%)的SPF层流罩中饲养,所有饲料、饮用水及垫料经高压灭菌处理,每3 d更换饲料、饮用水及垫料。

  1.2.4 RT-PCR检测转染siVEGF的A375细胞的VEGF表达变化

  转染后分别收集空白对照组、转染siVEGF1 、2 组和阴性对照质粒组的细胞,按Trizol 操作说明,分别提取总RNA,紫外分光光度计定量后逆转录。RNA样品经逆转录反应合成cDNA,进行PCR扩增。VEGF 扩增产物为485 bp,引物 序列: 5′-GAGGGCAGAATCATCACGAA-3′,5′-GGCTCCAGGGCATTAGACA-3′;GAPDH作为内参,其扩增产物为256 bp,引物序 列: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′,5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。扩增条件: 94 ℃变性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30个循环,最后72 ℃延伸10 min 。PCR产物经1%琼脂糖凝胶系统电泳(含0.5 g/L溴化乙啶),并通过凝胶成像分析电泳条带光密度值,以VEGF与内参GAPDH比值确定其含量。

  1.2.5 MTT 法检测细胞增殖情况

  取对数生长期A375细胞,以5×103/孔接种于96孔板,培养至细胞融合率达80%~95%时转染,分别转染siVEGF1、2和阴性对照质粒,空白组只加转染试剂。分别于12、24、48及72 h后每孔加入15 μl MTT (5 g/L) 培养4 h,每孔加入100 μl的DMSO,充分混匀,酶标仪570 nm处测定吸收度(A)值。据公式计算出抑制率:细胞增殖抑制率(%)=(1-处理组A570/未处理组A570)×100%,每组均设3个平行孔,取平均值作为1次实验结果,并重复3次。

  1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

  转染后继续培养72 h后收集各组的A375细胞,PBS洗涤,70%冰乙醇固定,碘化丙啶染色,流式细胞仪检测。通过软件Multicycle进行分析,以DNA含量为横坐标,受检细胞为纵坐标作图,用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。G1峰前面出现的亚2倍体峰即为凋亡峰。

  1.2.7 裸鼠异体肿瘤接种实验

  24只裸鼠,随机分为4组,每组6只。A375细胞转染2组siRNA VEGF后进行稳定筛选,培养各组稳定转染的细胞直至对数生长期,0.25%胰酶消化并计数,离心后取200 μl(1×105个细胞/μl)悬浮细胞,加入不含血清的IMDM制成细胞悬液,选择裸鼠臀部外侧,消毒后皮下注射0.1 ml细胞悬液,每日观察成瘤情况。

  1.3 统计学分析

  采用SPSS13.0软件分析,组间比较采用单因素方差分析,率的比较用χ2检验。

  2 结 果

  2.1 重组质粒的鉴定

  双酶切后电泳验证pSilencer-siRNA-VEGF真核表达载体构建正确。并且测序结果与所设计的编码相应短发夹状siRNA-VEGF的寡核苷酸链的序列一致,证明质粒构建成功。

  2.2 siVEGF对A375细胞VEGF 表达的抑制

  RT-PCR结果显示: 转染siVEGF1、siVEGF2 后48 h 的A375细胞与空白对照组比较VEGF 基因表达水平分别降低了59.92 %和69.63 %;转染阴性对照质粒组的 VEGF 表达为空白对照组的97%,与对照组比较无显著性差异(P>0.05) 。见图1。说明siRNA VEGF能有效地抑制A375细胞的VEGF基因表达。1~4分别为空白组、阴性对照质粒组、转染siVEGF1组、转染siVEGF2组图1 转染后各组A375中VEGF mRNA的表达变化

  2.3 siVEGF 对A375细胞增殖的抑制

  MTT法检测A375细胞的增殖抑制情况,结果显示: 转染阴性对照质粒组细胞增殖抑制不明显,抑制率与空白组无显著性差异,转染siVEGF1和siVEGF2组细胞生长受到明显抑制,并且转染siVEGF 真核表达载体 12 、24 、48 及72 h后,A375细胞的增殖抑制率随时间的延长而增加,组间比较差异具有显著性 (P<0.05) 。见图2。说明增殖抑制效应具有时间依赖性,转染siVEGF后增殖能力明显低于对照组。图2 转染后各组A375细胞增殖抑制率

  2.4 siVEGF 对A375细胞凋亡的影响

  转染siVEGF1和siVEGF2的A375细胞72 h后流式细胞术结果显示,凋亡率分别为33.8%和41.1%;然而,转染阴性对照质粒组凋亡率为2.5%,未见明显凋亡,空白对照组也未产生凋亡。可见siVEGF有不同程度诱导A375细胞凋亡的作用,而且siVEGF2诱导凋亡的效果更显著。

  2.5 siVEGF对A375细胞成瘤率的影响

  裸鼠接种各组A375细胞后,对照组和control siRNA组于接种细胞后10 d左右肉眼均可见局部肿瘤形成,成瘤率达100%;两组转染siVEGF组在近接种细胞后第20天时, si VEGF-A375细胞组成瘤率分别为66.7%和50%,余下的在第30天(处死当日)仍无肿瘤形成。si MDM两组细胞成瘤率和对照组比具有极显著差异(P<0.05)。

  3 讨 论

  恶性黑素瘤是一种严重威胁人类健康的皮肤科肿瘤性疾病,近年来在世界范围内恶性黑素瘤的发病率呈现 上升趋势,1991年美国报道恶性黑素瘤病例数大约为过去40年恶性黑素瘤病例数总和的3倍。虽然不少新的治疗方法不断出现,但是化疗仍然是恶性黑素瘤最重要的治疗方法之一,而恶性黑素瘤细胞对化疗抵抗,预示着恶黑患者将会有不良预后。因此寻找一种化疗增敏剂,增加恶性黑色素瘤对化疗的敏感性,减低化疗的毒副作用成为一重要课题〔6~8〕。

  近年来的研究证实,肿瘤发生时,病灶及瘤周将会发生持续的、失控的血管生长;恶性肿瘤的发生、发展及转移的各个阶段均有赖于新生血管的形成〔9〕。VEGF是目前已知活性最强,专属性最高的 血管生长因子,其他血管生长因子大都通过增强 VECF的表达产生促进血管生成的作用。VEGF一方面可能通过促进肿瘤周围淋巴管形成,从而使癌细胞沿淋巴道转移;另一方面也可以通过增加血管通透性使癌细胞通过血循环转移到远处脏器,从而在肿瘤的脉管转移中起一定作用。研究表明,黑色素瘤细胞系的转移能力与细胞本身VEGF表达分泌的水平有密切关系。

  近年来肿瘤的基因治疗使肿瘤的治疗进入崭新 的领域,基因治疗具有不易产生耐药性、不受肿瘤细 胞周期限制、特异性强及对原发肿瘤和转移瘤均有 良好疗效等优点〔4〕。siRNA是一类长约21~23个核苷酸的特殊 dsRNA分子,与所作用的靶mRNA 序列具有同源性。由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA 分子而诱导基因特异性抑制反应〔10〕。基于RNAi技术的特点,将其用在黑色素瘤VEGF的基因治疗方面,具有独特作用。研究表明 VEGF siRNA在体内和体外均可减少VEGF mRNA 的表达,从而减少血管内皮细胞增殖,抑制肿瘤转移。

  本研究结果表明,本研究组设计合成的siVEGF 能有效地阻抑 VEGF 基因的表达。同时MTT和流式细胞术 检测结果表明: 瞬时转染siVEGF 能有效抑制A375细胞增殖,并诱导肿瘤细胞凋亡。这种表达载体能够在哺乳动物细胞中长时间、稳定地抑制目的基因表达,引起基因沉默。同时本研究构建的质粒可以明显抑制肿瘤的成瘤率,本研究组正在进行该质粒对肿瘤转移的抑制效果的研究。总之,对肿瘤患者采用联合疗法即手术疗法、放疗和(或) 化疗并联合使用VEGF siRNA,可能会取得很好的疗效。不过,真正使用RNAi 技术应用于临床治疗还需要进一步广泛深入细致的研究。

  本研究应用siRNA 技术,构建了重组质粒PsilencerTM-VEGF-siRNA,并成功导入黑色素瘤细胞A375,证明了siVEGF 确实可以特异、有效地抑制VEGF 的表达和黑色素瘤A375细胞的体外生长。说明将VEGF作为靶位点,应用RNA 干扰技术进行肿瘤生物治疗在理论上是可行的,为黑色素瘤基因治疗开辟了新的思路,提供了实验数据。

【参考文献】
    1 Sawada S,Mese H,Sasaki A,et al.Combination chemot herapy of paclitaxel and cisplatin induces apoptosis wit h bcl-2 phosphorylation in a cisplatin2resistant human epidermoid carcinoma cell line〔J〕.Cancer Chem Pharmacol,2003;51(6):505-11.

  2 Kim HN,Kim H,Kong JM,et al.Vitamin C down-regulates VEGF production in B16 F10 murine melanoma cells via the suppression of p42/44 MAPK activation〔J〕.J Cell Biochem,2011;112(3):894-901.

  3 Barak V,Pe′er J,Kalickman I,et al.VEGF as a biomarker for metastatic uveal melanoma in humans〔J〕.Urr Eye Res,2011;36(4):386-90.

  4 Frank NY,Schatton T,Kim S,et al.VEGFR-1 expressed by malignant melanoma-initiating cells is required for tumor growth〔J〕.Cancer Res,2011;71(4):1474-85.

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  7 Khosrotehrani K,Nguyen Huu S,Prignon A,et al.Pregnancy promotes melanoma metastasis through enhanced lymphangiogenesis〔J〕.Am J Pathol,2011;178(4):1870-80.

  8 李 林,田 辉,王善政.老年原发性食管恶性黑色素瘤临床特征的研究〔J〕.中国老年学杂志,2009;29(13):80-3.

  9 Kim HN,Kim H,Kong JM,et al.Vitamin C down-regulates VEGF production in B16F10 murine melanoma cells via the suppression of p42/44 MAPK activation〔J〕.J Cell Biochem,2010;12(29):70-3.

  10 Mammalian SY.RNAi for the masses〔J〕.Trends Genet,2003;19 (1) : 9-12.

  (编辑 徐 杰)

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