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肝脏CT量化非酒精性脂肪性肝病兔肝组织硫化氢浓度

首席医学网      2012年07月22日 14:01:47 Sunday  
 
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作者:谭华炳 王一平 任永生1 胡小林2 王记红2 高玉玖2     作者单位:1 湖北医药学院基础医学院生理学教研室 2 湖北医药学院第三临床学院 (湖北医药学院附属人民医院感染性疾病科,湖北 十堰 442000)

【摘要】  目的 研究肝脏CT值量化非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)兔肝组织硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)浓度的可行性。方法 40只日本大耳白兔随机分为重度NAFLD组(重度组)、轻度~中度NAFLD组(轻度组)、空白对照组(对照组)。重度组给予高脂饲料160 g/d,轻度组给予高脂饲料80 g/d + 普通饲料80 g/d,对照组给予普通饲料160 g/d。饲养至10 w开始每周对重度组肝脏CT检测了解NAFLD程度,至13 w重度组达到重度NAFLD,终止实验,确定饲养周期13周。饲养前耳中动脉采血5 ml于肝素管中,离心取血浆保存于-20℃的冰柜中待检。实验结束,10%水合氯醛耳缘静脉麻醉,兔固定于木制固定器上,进行肝脏CT检测。腹主动脉抽血5 ml于肝素管中,离心取血浆保存于-20℃的冰箱中待检。全部血浆按照设备、试剂操作常规检测实验前后甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)。肝组织匀浆检测肝组织H2S浓度。HE染色,光学显微镜观察肝脏组织形态学改变。结果 (1)TG、TC检测结果:饲养前重度组、轻度组、对照组TC、TG比较无统计学差异(P>0.05)。饲养后重度组TC、TG分别为(32.12±1.25)、(6.02±2.12) mmol/L,轻度组TC、TG分别为(18.34±2.10)、(4.39±1.93) mmol/L,与饲养前比较有统计学差异(P<0.01)。饲养后重度组TG、TC高于轻度组(P<0.01)。(2)肝组织H2S浓度:重度组、轻度组肝组织H2S明显下降,重度组、轻度组与对照组比较均有统计学差异(P<0.01);重度组与轻度组比较也有统计学差异(P<0.05)。(3)肝脏CT值:重度组肝脏CT值(31.3±2.4)、轻度组肝脏CT值(42.1±3.5)与对照组肝脏CT值(58.9±1.9)比较有显著差异(P<0.01);重度组肝脏CT值低于轻度组,有显著性差异(P<0.01)。(4)肝脏病理学:重度组呈重度NAFLD改变,轻度组呈轻度~中度NAFLD改变,对照组为正常肝脏形态。结论 NAFLD兔肝脏CT值和脂肪肝程度、肝组织H2S浓度下降有关,可以通过肝脏CT值无创性量化肝组织H2S浓度,评价NAFLD治疗效果。

【关键词】  肝脏CT值;非酒精性脂肪性肝病;硫化氢;量化;动物

  【Abstract】 Objective To study the feasibility of CT value of rabbit with nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD) to quantificat hydrogen sulfide density of liver tissue.Methods 40 Japanese white rabbits were randomly divided into severe NAFLD, mild NAFLD, blank control groups.Severe group was given high fat diet 160 g/d, mild group was given high fat diet 80 g/d and normal diet 80 g/d, blank control group was given normal feed 160 g/d. The raising cycle was 13 w. At the end of the test, the livers of all the rabbits were examined by CT. The levels of triglyceride(TG), total cholesterol(TC) were measured before and after test. Hydrogen sulfide density of liver organization refining was measured. Pathological changes of liver tissue were observed by light microscope.Results ⑴Before fed, the levels of TC, TG were no significant difference between severe, mild and control groups (P>0.05).The levels of TG, TC were higher after fed than those before fed, and those were higher in severe group than those in mild group after fed. ⑵ The density of H2S in liver tissue were decreased in severe and mild groups than that in control group(P<0.01), and there was significant difference between severe group and mild group (P<0.05). ⑶The CT value of severe and mild groups were significant difference compared with that in control group (P<0.01). The CT value of severe group was lower than that in mild group (P<0.01). ⑷ The liver pathology was severe NAFLD change in severe group, and it appeared mild NAFLF change in mild group, and it was normal liver in control group.Conclusions There are relationships between the CT value of liver, the degree of fatty liver with NAFLD and the reduction of hydrogen sulfide density of liver tissue, through testing the CT value, hydrogen sulfide density of liver tissue can be quantificat, the curative effect of NAFLD can be appraised.

  【Key words】 CT value; NAFLD; Hydrogen sulfide; Quantificat

  非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)与胰岛素抵抗(IR)互为因果,共同促进肝炎、肝纤维化及2型糖尿病(T2DM)和动脉硬化的发生和发展〔1〕。影像学检查提示脂肪肝的有无为IR和代谢综合征的“晴雨表”〔2〕。CT可以对NAFLD量化观测〔3〕。硫化氢(H2S)是机体心血管功能调节的新型气体信号分子〔4〕。H2S与肝硬化密切相关〔5,6〕,本课题组前期研究也证实H2S与NAFLD相关。由于人体肝组织难于取得,本研究试图探索应用肝脏CT量化肝组织H2S浓度,为临床脂肪肝研究中推测肝组织H2S浓度与疗效的关系提供依据。

  1 材料与方法

  1.1 动物与材料

  40只日本大耳白兔(雌雄各半),体重(2.2±0.2)kg,湖北医药学院动物实验中心提供(合格证号:No.00006546)。实验地点:湖北医药学院临床医学研究所,湖北省十堰市实验动物中心(实验设施使用证明号:No.00008391)。普通饲料由湖北医药学院动物实验中心提供,高脂饲料由湖北医药学院动物实验中心按实验配方配制成成品使用(配方:86%普通饲料+2%胆固醇+6%蛋黄+6%猪油),胆固醇购自北京双旋生物培养基制品厂(批号:2009.07.15),猪油由市售板油自行炼制而成,蛋黄粉由市售鸡蛋自行制作。甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)检测试剂为瑞士Roche/Hitache公司原装进口试剂。

  1.2 设备

  螺旋CT(美国产,GE Lightspeed 16层螺旋CT)。全自动生化检测仪(瑞士Roche/Hitache7600),冷冻低温离心机(上海中科生物医学高科技开发有限公司,DL-45R-L),Olympus DP-70显微摄影系统(日本奥林巴斯公司)。肝组织H2S检测设备、试剂为北京大学生理学系全套设备和专用试剂。

  1.3 实验模型的建立

  1.3.1 动物分组与饲养

  用普通饲料饲养观察1 w,无不良反应后,将40只兔分为3组,重度NAFLD模型组(重度组,n=14):给予高脂饲料160 g/d。轻度NAFLD模型组(轻度组,n=13):给予高脂饲料80 g/d + 普通饲料80 g/d。空白对照组(对照组,n=13):给予普通饲料160 g/d。上午9时、下午5时各投入一半饲料。全部动物单笼、单兔喂养,自由饮水。分别建立重度NAFLD动物模型、轻~中度NAFLD动物模型、空白对照动物模型。

  1.3.2 饲养周期与NAFLD程度的观测

  饲养至10 w开始每周对重度组行肝脏CT了解NAFLD的程度,至13 w重度组达到重度NAFLD,终止实验确定实验周期为13 w。

  1.4 标本采集与检测

  1.4.1 肝脏CT检测

  10%水合氯醛耳缘静脉麻醉,仰卧固定于木制手术台上,CT检测肝脏,计算肝组织CT值。

  1.4.2 血液的采集与检测

  实验前耳中动脉采集血液标本5 ml于肝素管,离心取血浆,保存于-20℃的冰柜中待检。13 w末,10%水合氯醛耳缘静脉麻醉,腹主动脉采集血液5 ml于肝素管,离心取血浆,保存于-20℃的冰柜中待检。同步按仪器和试剂说明书检测饲养前后血浆TG、TC水平。

  1.4.3 肝组织H2S检测

  将肝组织匀浆加入预先配制好的反应体系中(反应体系由100 mmol/L pH7.4磷酸钾缓冲液、10 mmol/L的L-半胱氨酸、2 mmol/L的5′磷酸吡哆醛组成),使组织匀浆占反应系的10%。吸取1%醋酸锌0.5 ml吸收液加入中央室,另剪裁2 cm×2.5 cm的滤纸置入中央室,以增加空气/液体接触面积。将内盛反应体系及中央室25 ml锥形瓶用氮气充盈后,以石蜡膜双层封口。转移锥形瓶至37℃水浴摇床中摇荡反应90 min后,在反应体系中加入0.5 ml的50%三氯醋酸终止反应。再次石蜡膜封闭锥形瓶,继续37℃水浴反应60 min,使反应体系中释放出的H2S被完全吸收。将中央室的内容物转移到预先加3.5 ml水的试管中,立即加入0.5 ml的7.2 mol/L含盐酸对苯二胺的盐酸溶液,再加入0.4 ml的1.2 mol/L含三氯化铁的盐酸溶液,20 min后测665 nm波长处的吸光度值。通过标准曲线计算H2S的转化率,结果以nmol·min-1·g-1组织表示。

  1.4.4 肝脏标本的采集与检测

  在肝脏最大叶边缘0.5 cm处取1.5×1.5×1.5 cm3肝组织1块,浸泡于10%甲醛固定液固定48 h,脱水石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肝脏组织形态学改变。

  1.5 统计学分析

  采用SPSS9.0统计学,数据以x±s表示,治疗前后组内及组间比较用t检验。

  2 结 果

  2.1 TG、TC变化

  对照组饲养前后TG、TC比较无差异;重度组、轻~中度组饲养后TG、TC升高,与饲养前比较有非常显著差异(P<0.01);重度组与轻中度组比较有非常显著差异(P<0.01)。见表1。

  2.2 肝脏CT值的比较

  重度组、轻~中度组动物肝脏的CT值下降,与对照组比较分别有非常显著的差异(P<0.01);重度组的CT值明显低于轻~中度组,组间比较有显著性差异(P<0.01)。见表1。

  2.3 肝组织H2S变化

  重度组(51.12±5.97)、轻~中度组(57.51±5.87)肝组织H2S与对照组(77.24±2.24)比较明显下降(P<0.01),重度组与轻度组比较有显著差异(P<0.05)。

  2.4 肝脏病理学

  重度组动物达到重度NAFLD程度,轻度组达到轻度~中度NAFLD改变,对照组为正常肝脏形态。实验造模成功,符合实验设计。表1 三组饲养前后血脂、肝脏CT值变化

  3 讨 论

  H2S作为气体信号分子,在NAFLD兔肝组织H2S浓度下降(课题组另文报道)。本研究证实,NAFLD可以通过肝脏CT值量化脂肪肝程度。本研究通过剂量控制法建立不同程度兔脂肪肝模型,通过CT检测、肝组织H2S浓度检测,探讨通过肝脏CT值量化肝组织H2S浓度的可行性。

  肝脏病理学显示重度组为重度NAFLD改变,轻度组为轻~中度NAFLD改变,对照组肝脏形态正常。肝脏CT与肝组织H2S浓度对比分析发现:脂肪肝程度加重与肝脏CT值、肝组织H2S浓度下降有关。

  脂肪肝的影像学诊断指标中,彩色超声检查诊断NAFLD的敏感性、特异性均不高,且不能量化脂肪肝的程度;MRI在脂肪肝的诊断中也存在敏感性、特异性不高的问题;肝脏CT是脂肪肝诊断最佳指标的观念已得到医学界的公认,脂肪肝时随脂肪肝程度的加重肝脏CT值下降。

  肝脏是体内H2S生成的主要部位,对维持循环血液中H2S的浓度起到重要作用,而H2S在调节正常及肝硬化的微循环中的作用也已被证实〔7〕。NAFLD导致肝血管重构使肝组织缺血缺氧,内源性H2S作为气体信号分子首先被消耗,从而导致肝组织H2S水平下降,且与NAFLD程度成反比。笔者认为,肝脏CT值下降程度可以作为肝组织H2S浓度的间接量化指标,指导NAFLD的治疗。

【参考文献】
    1 Fan JG,Farrell GC.VAT fat is bad for the liver,SAT fat is not〔J〕. Gastroenterol Hepatol,2008;23(6):822-5

  2 Fan JG.Impact of non-alcoholic fatty liver disease on accelerated metabolic complications〔J〕.J Dig Dis,2008;9(2):63-7.

  3 谭华炳,贺 琴.肝脏CT值与动脉粥样硬化关系〔J〕.中国比较医学杂志,2008;18(3):19-22.

  4 耿 彬,闫 辉,钟光珍,等.硫化氢——心血管功能调节的新型气体信号分子〔J〕.北京大学学报:医学版,2004;36(1):106.

  5 张 宁,郑 勇,王于理,等.内源性硫化氢在不同时期大鼠肝硬化中的作用〔J〕.世界华人消化杂志,2009;17(3):307-11.

  6 张 艳,张 伟.气体信号分子硫化氢在肝硬化患者中的表达和意义〔J〕.河北医学,2009;15(6):649-51.

  7 Fiorucci S,Antonelli E,Mencarelli A,et al.The third gas:H2S regulates perfusion pressure in both the isolated and perfused normal rat liver and in cirrhosis〔J〕.Hepatology, 2005;42:539-48.

  (编辑 徐 杰)

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