您所在位置: 首页 > 期刊 > 过刊浏览 > 内科学> 《中国老年学杂志》> 2012年11月31卷22期>文章> 文章详情

IGF-1对Rh1肉瘤细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

首席医学网      2012年07月22日 14:03:32 Sunday  
 
  加入收藏夹   官方投稿信息

作者:金家红 黄文峰    作者单位:(三峡大学医学院,湖北 宜昌 443002)

【摘要】  目的 探讨胰岛素样生长因子(IGF)1对Rh1肉瘤细胞生长活性和PI3K/Akt/mTOR信号通路的背景变化。方法 常规细胞培养,用无血清培养基消除内源性因子影响27 h,再用IGF-1 (终浓度为10 ng/ml)刺激72 h,流式细胞仪检测细胞生长活性;另外Western印迹方法观察IGF-1刺激细胞5、10、20、30和60 min后 Akt (s473)、S6的动态变化。结果 与对照组相比,IGF-1可促进Rh1细胞存活。IGF-1刺激不同时间后S6磷酸化则随着时间的延长逐渐增强;IGF-1亦导致Akt (s473)位点的磷酸化,随时间的延长,磷酸化Akt在5 min时达高峰,此后逐渐减弱。结论 Akt、S6等是PI3K/Akt/mTOR信号通路中的重要信号分子,对Rh1 细胞而言,在IGF-1刺激下S6有逐渐增强的变化,Akt (s473)位点磷酸化则有减弱的动态变化。

【关键词】  IGF-1; PI3K/Akt/mTOR

  【Abstract】 Objective To investigate the growth activities and the background changes of PI3K/Akt/mTOR pathway with the stimulation of IGF-1 in Rh1 sarcoma cells. Methods Rh1 cells were cultured with 10% FBS RPMI1640 media to firstly abolish the effect of the inner substances, the cells were starved with the pure RPMI1640 for 27 h, then the IGF-1 was added (final concentration 10 ng/ml) for stimulating 5, 10, 20, 30 and 60 minutes separately. The flow cytometer was used to determine the cell growth activities and western blot method was used to observe dynamic changes of Akt (s473) and S6. Results Compared to control, IGF-1 could promote the survival of Rh1 cells. The phosphorylation of S6 was increased gradually. IGF-1 also could give rise to the phosphorylation of Akt (s473). And the peak of phosphorylation was present at 5 minutes, and then decreased gradually. Conclusions With the stimulation of IGF-1, the increased dynamic changes of S6 and the decreased dynamic changes of Akt (s473) exist in Rh1 cells.

  【Key words】 IGF-1; PI3K/Akt/mTOR

  胰岛素样生长因子(IGF)-1信号途径是一类具有促进肿瘤细胞增殖、分化以及血管形成的生长因子信号通路。目前认为PI3K/Akt/mTOR途径是介导IGF-1抗凋亡作用最强的通路,另外MAPKase的活化也参与IGF-1信号的放大,二者最终通过Bcl-2家族中调节因子Bad的磷酸化阻止了Caspase的活化,从而发挥抗凋亡作用〔1〕。尽管针对PI3K/Akt/mTOR信号途径已经设计了众多的分子靶向药物,有的已进入临床试验〔2〕,这些药物均能有效抑制IGF-1刺激时PI3K/Akt/mTOR通路的活化,但目前尚不清楚IGF-1引起的PI3K/Akt/mTOR信号通路的背景变化,因此,在评价这些药物的效果时,特别是用Akt (s473)和S6作为抗癌药物的筛选靶点时,应考虑到磷酸化Akt (s473)和S6的背景变化。关于IGF-1刺激肿瘤细胞时S6和Akt的背景变化尚未见报道,本研究以一种人横纹肌肉瘤细胞(Rh1)为对象,探讨IGF-1对Rh1细胞生存活性的影响以及对Akt (s473)和S6的背景变化。

  1 材料与方法

  1.1 细胞培养

  人横纹肌肉瘤细胞株Rh1细胞由美国St.Jude儿童研究医院Peter教授提供。Rh1细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基,在37℃,5% CO2饱和湿度条件下培养,每2~3天传代1 次。

  1.2 抗体及特殊试剂

  抗体均购自Cell Signaling Technology 公司;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒为Biosciences公司产品,BCA蛋白定量及ECL显色试剂盒均购自PIERCE公司。

  1.3 流式细胞术检测凋亡

  Rh1细胞以104个种于培养瓶中,用完全培养基培养27 h后换用不含胎牛血清的RPMI1640培养基,加入IGF-1(终浓度为10 ng/ml)后继续培养72 h,消化后制备细胞悬液,离心弃上清后用预冷PBS缓冲液洗2次, 取总数为106个细胞用于测定。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的AnnexinⅤ和碘化丙锭(PI)染色按说明书操作,最后用流式细胞仪作凋亡分析。

  1.4 免疫印迹

  Rh1细胞以105个种于6孔板中,用完全培养基培养27 h后再用不含胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养14 h,再用IGF-1(终浓度为10 ng/ml)刺激细胞5、10、20、30和60 min后收集总蛋白,用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量,取20 μg蛋白质用于SDS-PAGE电泳,电转移至PVDF膜上,各种抗体封闭过夜后用ECL显色获取结果,以tubulin作为内参。

  1.5 统计分析

  数据以x±s表示,采用SPSS13.0 统计软件进行t检验。

  2 结 果

  2.1 IGF-1促进Rh1细胞的生长

  Rh1细胞在无血清的单纯培养基中生长72 h,流式细胞仪检测其凋亡率为(28.0±2.0)%;当在单纯培养基中给予IGF-1(10 ng/ml)刺激时则明显促进了细胞的生长,流式细胞仪检测其凋亡率为(11.4±1.2)%。两者有明显统计学差异(P<0.05),表明IGF-1有减少细胞凋亡而促进细胞生长的作用。

  2.2 IGF-1刺激时对Akt (s473)和S6的背景变化

  Rh1细胞分别用IGF-1(10 ng/ml)刺激不同时间时,免疫印迹结果发现,IGF-1刺激均引起Akt (S473)位点的磷酸化,随时间的延长,磷酸化Akt在5 min时达高峰,此后逐渐减弱;而S6位点的磷酸化则随着时间的延长逐渐增强,在60 min时可见最大,总S6和总Akt没有变化。IGF-1刺激时对Akt(S473)的磷酸化有自然减弱的过程,而S6的磷酸化则有自然增强的过程,见图1。图1 IGF-1刺激时对Akt (s473)和S6的背景变化

  3 讨 论

  肿瘤的发生和进展非常复杂,其机制与众多的生长因子信号转导通路异常有关;这些细胞信号通路既各自独立,又互相交织成网,形成交叉对话。通过对这些生长因子信号通路的研究有助于形成一种新的肿瘤生物治疗模式,即以特异性单克隆抗体和小分子抑制剂及反义的寡核苷酸等为代表的高度特异的分子靶向治疗。利用这些分子靶向药物单独或者与其他治疗方式共同发挥抗癌作用,在临床应用上已经带来了良好的应用前景,为有效治疗肿瘤疾病带来了新的希望〔3,4〕。

  分子靶向治疗已经将癌症的治疗推向了一个前所未有的新阶段,分子靶向治疗能够特异性地作用于肿瘤信号转导通路中的关键靶分子,阻断相关信号的传递以影响肿瘤细胞的生长和代谢,进而达到治疗肿瘤的目的。例如抑制PI3K-Akt信号通路的曲妥珠单抗已成功运用于HER-2阳性早期乳腺癌患者,曲妥珠单抗辅助治疗能够使患者复发风险下降46%~52%,死亡风险下降1/3,因此曲妥珠单抗在HER-2阳性早期乳腺癌辅助治疗中占有重要地位〔5〕。

  mTOR由TORC1和TORC2两种复合物组成,被认为是肿瘤发生的危险因素,其活化与IGF-1信号途径关系相当密切,当IGF-1和胞膜上的受体结合以后会激活PI3K/Akt/mTOR信号〔6〕。由于mTOR在肿瘤生长信号中处于中心地位,已经引起了人们的极大兴趣,因此设计出了许多针对该条通路的特异性分子靶向药物〔7〕。一般来说,S6是TORC1的下游分子,而Akt则是TORC2的下游分子,二者的磷酸化状态也就分别代表TORC1和TORC2的功能,S6和Akt也就成了这些分子靶向药物的筛选靶点〔8〕。与许多研究结果一样,本结果也证实IGF-1能促进细胞生长而减少细胞凋亡,原因与PI3K/Akt/mTOR信号通路激活有关。本结果首次发现,在Rh1细胞中,S6位点的磷酸化随着时间的延长逐渐增强,在60 min时可见最大值,表明TORC1的功能在逐渐增强。IGF-1亦可使Akt (S473)位点磷酸化,磷酸化Akt在5 min时达峰值,此后逐渐减弱,表明TORC2的功能是从无到强,再慢慢减弱;对于总S6和总Akt而言则没有明显变化,表明IGF-1并不影响S6和Akt的基因表达。此结果表明,IGF-1刺激时S6的磷酸化则有自然增强的过程,而Akt (S473)的磷酸化有自然减弱的过程;相应的,IGF-1刺激时TORC1的功能逐渐增强,而TORC2的功能渐渐减弱。

  因此,在评价针对mTOR信号通路的分子靶向药物时,应当考虑到上述S6和Akt背景变化,以期反映TORC1和TORC2的功能变化。当TORC2磷酸化Akt后,可以又激活TORC1,但本结果发现TORC1和TORC2功能变化是反向变化的,因此本研究的较大意义还在于,能够激活TORC1的可能不仅仅是Akt,Akt在早期可以激活TORC1,当Akt功能减弱时,TORC1可能是其他磷酸酶所激活〔9〕,这方面研究尚需深入。

【参考文献】
    1 Pollak M.Insulin and insulin-like growth factor signalling in neoplasia〔J〕.Nat Rev Cancer,2008;8(12):915-28.

  2 Kurmasheva RT,Dudkin L,Billups C,et al.The insulin-like growth factor-1 receptor-targeting antibody,CP-751,871,suppresses tumor-derived VEGF and synergizes with rapamycin in models of childhood sarcoma〔J〕. Cancer Res,2009;69(19):7662-71.

  3 董 兵,朱毅敏.癌症分子靶向治疗的研究现状〔J〕.癌症,2010;29(3):370-5.

  4 Wenner CE.Cell signaling and cancer-possible targets for therapy〔J〕.J Cell Physiol,2010;223(2):299-308.

  5 Smith I,Procter M,Gelber RD,et al.2-year follow-up of trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer:a randomised controlled trial〔J〕.Lancet,2007;369(9555):29-36.

  6 郑鹏生,冀 静.mTOR信号通路与肿瘤的研究进展〔J〕.西安交通大学学报(医学版),2010;31(1):1-9.

  7 Sparks CA,Guertin DA.Targeting mTOR:prospects for mTOR complex 2 inhibitors in cancer therapy〔J〕.Oncogene,2010;29(26):3733-44.

  8 Kurmasheva RT,Huang S,Houghton PJ.Predicted mechanisms of resistance to mTOR inhibitors〔J〕.Br J Cancer,2006;95(8):955-60.

  9 Dibble CC,Asara JM,Manning BD.Characterization of Rictor phosphorylation sites reveals direct regulation of mTOR complex 2 by S6K1〔J〕.Mol Cell Biol,2009;29(21):5657-70.

  (编辑 张 慧)

  订阅登记:

请您在下面输入常用的Email地址、职业以便我们定期通过邮箱发送给您最新的相关医学信息,感谢您浏览首席医学网!

邮箱:    专业:    职称:      

医学期刊医学会议医学专区医学护理