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柴胡总皂苷对酒精性肝病大鼠肝脏转化生长因子-β1和α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

首席医学网      2012年07月22日 14:06:00 Sunday  
 
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作者:李素婷 王宝源 杨鹤梅 齐洁敏 王 冉    作者单位:(承德医学院,河北 承德 067000)

【摘要】  目的 研究柴胡总皂苷对酒精性肝病大鼠肝脏转化生长因子(TGF)-β1和α-平滑肌肌动蛋白(SMA)表达的影响,以探讨柴胡皂苷防治酒精性肝病的机制。方法 SD大鼠45只随机分为正常组、模型组、柴胡皂苷保护组,利用白酒灌胃辅以高脂饲料制备大鼠肝损伤模型,同时给予柴胡总皂苷(200 mg/kg)保护,每天一次,连续8 w,8 w末处死全部大鼠。测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性,观察肝组织病理形态学改变,检测肝组织TGF-β1和α-SMA的表达。结果 和模型组比较,柴胡皂苷能明显降低大鼠血清ALT、AST活性,减少肝细胞坏死和纤维组织增生;模型组肝组织中TGF-β1和α-SMA表达呈强阳性,给予柴胡皂苷后TGF-β1和α-SMA的表达明显降低。结论 柴胡皂苷对酒精性肝病具有一定的预防作用,其机制可能是通过抑制TGF-β1信号通路对肝星形细胞的活化,保护肝细胞的结构和功能,抑制细胞外基质在肝脏的分泌和沉积。

【关键词】  柴胡总皂苷;大鼠;酒精性肝病;TGF-β1;α-SMA

  酒精性肝病(ALD)是由于长期过量饮酒导致的中毒性肝损害。据统计,约2/3的酗酒者可发展成酒精性肝病,已逐渐发展为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病,是当今世界亟待解决的公共卫生问题〔1〕。开发并筛选对ALD有确切防治作用的中药新药并应用于临床,是当前面临的重要课题。柴胡为伞形科植物柴胡的根部,具有解表退热、疏肝解郁、升举阳气的功效。柴胡的主要有效成分为柴胡皂苷(SS),具有抗炎、镇痛、降血脂等多方面药理作用〔2,3〕。本实验观察柴胡总皂苷对实验性ALD的防护作用和可能的机制。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 动物

  SD大鼠,雄性,清洁级,体重(200±21) g,北京实验动物管理中心提供。

  1.1.2 药品与试剂

  柴胡总皂苷(纯度为30∶1):昆明长春花科技有限公司提供,临用前以蒸馏水配置;56度红星二锅头白酒:北京红星酿酒厂生产;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒:北京中生生物工程公司。转化生长因子-β1(TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单抗:购于武汉博士德工程有限公司。

  1.1.3 主要仪器

  半自动生化分析仪(MD-100):美国Bayer公司生产,721W微机型分光光度计:上海光学仪器五厂,Olympus光学显微镜和摄像显微镜:德国Leica公司。

  1.2 方法

  1.2.1 动物分组及模型的建立〔4〕

  取SD大鼠45只,随机分为3组。①酒精组(20只),56度红星二锅头白酒用蒸馏水配制成酒精40%的白酒,按10 ml/kg每日分两次灌胃造模4 w,第5周酒精浓度升至50%,按10 ml/kg每日分2次继续灌胃4 w,并辅以高脂饲料(由颗粒料、胆固醇和猪油按79∶1∶20的比例微波炉加热制成)。②柴胡皂苷组(15只),除每天灌胃白酒和高脂饲料外(方法同酒精组),每天上午11点灌胃柴胡总皂苷200 mg/kg;③正常组(10只),普通饲料通常方法喂养,自由进食、饮水,每天下午用等体积蒸馏水灌胃。各组于造模起第8周末断头处死大鼠。取血分离血清,取大鼠肝脏并称重,在肝右叶同一部位切去肝组织,生理盐水冲洗后,置10%甲醛溶液固定,24 h内制成蜡块。

  1.2.2 指标测定

  1.2.2.1 肝功能指标检测

  应用半自动生化分析仪按赖氏法测定血清ALT、AST活性。

  1.2.2.2 肝脏切片形态学观察

  取石蜡包块进行常规切片,每张切片厚度为4 μm,作HE染色和V-G胶原纤维特殊染色,肉眼观察和光镜下观察肝组织病理改变和纤维增生和分布情况。并参照文献〔5〕制定的肝纤维化评定标准,在光镜下观察纤维化情况并进行评分。

  1.2.2.3 免疫组化法检测肝组织TGF-β1和α-SMA的表达

  取各组组织切片,磷酸盐缓冲液浸泡,梯度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,采用SABC法检测TGF-β1、α-SMA在大鼠肝组织中的表达,结果判定参考文献〔6〕。

  1.3 统计学处理

  实验数据以x±s表示,用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析,组间比较采用t检验。

  2 结 果

  2.1 柴胡皂苷对ALD大鼠血清ALT、AST、活性的影响

  和正常组比较,酒精组大鼠血清中ALT、AST活性显著升高(P<0.01),而与酒精组相比,柴胡皂苷可明显降低大鼠血清中ALT、AST活性(P<0.01)。表明柴胡皂苷能够保护大鼠肝细胞、稳定肝细胞膜的结构,对酒精性肝损伤具有保护作用。见表1。表1 柴胡皂苷对ALD大鼠血清ALT、AST活性的影响

  2.2 肝组织病理学观察

  肉眼观察:正常大鼠肝脏外观红润,表面光滑,质地较软;模型组大鼠外观呈黄褐色,表面粗糙,有许多细小结节,质地较脆;SS保护组肝脏表面稍有粗糙,质地中等,形态接近正常。HE染色:正常组肝组织结构正常,肝细胞索排列整齐,肝小叶结构完整,在肝细胞窦及汇管区有少量成纤维细胞,无肝细胞脂肪变性坏死;模型组大鼠肝组织病理损伤严重,肝小叶结构紊乱,肝细胞呈气球样变及脂肪变性,肝细胞肿胀,胞质疏松,可见较大脂滴;汇管区有炎症细胞浸润,纤维组织增生明显,胶原纤维沿汇管区及中央静脉周围向肝小叶内延伸,肝小叶失去正常的结构特点。柴胡皂苷保护组上述症状明显减轻,肝细胞有轻度空泡样变性,纤维组织增生明显减少。V-G染色:正常组结果同HE染色,无纤维化模型组汇管区可见大量胶原纤维,伸入肝小叶形成纤维间隔,肝窦内有断续状胶原纤维沉积。柴胡皂苷保护组胶原纤维增生有不同程度的改善,纤维隔明显变薄。肝纤维化积分:与模型组相比(18.48±2.42)分,柴胡皂苷保护组肝纤维化积分有明显改善〔(13.78±1.82)分,P<0.01〕。

  2.3 肝组织TGF-β1、α-SMA的表达及量化结果

  肝组织切片免疫组化染色显示:大鼠肝组织TGF-β1、α-SMA的表达以肝细胞胞浆为主,着色为黄色或棕黄色。正常组肝组织中α-SMA主要表达于汇管区动、静脉壁,而模型组α-SMA在汇管区、纤维间隔和肝血窦处均呈阳性表达;柴胡皂苷保护组α-SMA表达较模型组有明显减弱,仅在汇管区和纤维间隔内有少量阳性细胞。正常肝组织中微弱表达TGF-β1蛋白,显色很淡,模型组TGF-β1阳性信号明显增强,阳性染色分布于变性的肝细胞、纤维化区、汇管区和血管壁,柴胡皂苷保护组TGF-β1表达明显降低,结果统计学分析有显著差异(P<0.05)。见表2。表2 柴胡皂苷对大鼠肝组织TGF-β1及α-SMA表达量化结果的影响

  3 讨 论

  肝纤维化的形成是肝细胞的慢性损伤、炎症和不断的组织重建,造成大量细胞外基质(ECM)在肝脏广泛沉积的病理过程。虽然多种细胞均能合成ECM,但肝星状细胞(HSC)是肝纤维化中ECM的主要来源和肝纤维化过程起主要作用的细胞。各种致病因素造成肝损伤时,肝枯否细胞、窦内皮细胞以及坏死的肝细胞等分泌多种细胞因子如TGF-β1、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)等,随同血小板、肝窦内皮细胞等分泌多种细胞因子,共同作用于肝HSC,其结果是HSC发生基因表达和表型改变,表现为转录活化、信号分子活化及诱导早期结构基因表达,使其细胞膜上表达多种细胞因子(如PDGF、TGF-β1)受体,对细胞因子产生应答,增殖并转化为肌成纤维细胞,表达α-SMA,具有收缩性、炎症性和高增殖性,并合成大量的ECM在肝脏沉积〔7〕。因此,检测α-SMA在肝脏的过度表达是判断HSC活化的标志。目前研究表明,转化生长因子β1是促肝纤维化最强的细胞因子,活化的HSC是TGF-β1的主要来源〔8〕。肝损伤时,HSC、枯否细胞及其他细胞通过自分泌或旁分泌方式产生大量TGF-β1,TGF-β1通过自身调节机制,刺激上述细胞产生更多的TGF-β1,形成级联放大效应,导致TGFβ1的大量生成和激活。激活的TGF-β1与细胞膜上的相应受体结合,使受体活化并作用于特异的受体蛋白向细胞内传递信号,调节靶基因表达。主要表现为:刺激肝HSC活化和向肌成纤维细胞转化;诱导基质基因的表达;抑制细胞外基质的降解〔9〕。因此,抑制肝组织TGF-β1的表达和HSC的活化,是对酒精性肝损伤保护作用的重要环节。本研究结果显示SS对酒精性肝病有明显的预防作用,其机制可能是:保护肝细胞的结构和功能,抑制TGF-β1信号传导对肝星形细胞的活化,减少细胞外基质的大量分泌和异常沉积。

【参考文献】
    1 庄 辉.酒精性肝病的流行病学〔J〕.中华肝脏病杂志,2003;1(11):698.

  2 何美姗,孙小玉.正柴胡饮颗粒的解热及抗过敏作用〔J〕.中成药,2002;24(8):284-5.

  3 于庆海.柴胡皂苷的抗炎作用初探〔J〕.沈阳药学院学报,1986;3(1):14-6.

  4 李舒丹,厉有名,虞朝辉.大鼠慢性酒精性肝损伤模型的建立〔J〕.浙江医学,2002;24(9):524-6.

  5 王泰龄,刘 霞,周元平,等.慢性肝炎炎症活动度及肝纤维化程度记分方案〔J〕.中华肝脏杂志,1998;6(4):195-6.

  6 欧阳灿辉,朱 萱,张琨和,等.熊果酸对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β2和α-SMA表达的影响〔J〕.世界华人消化杂志,2009;17(22):2237-43.

  7 张春燕.肝星形细胞的活化对肝纤维化形成的影响〔J〕.当代医学,2007;131(12):170-2.

  8 Gressner AM,Weiskirchen R.Modem pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF beta as major players and therapeutic targets〔J〕.Cell Mol Med,2006;10(1):76-99.

  9 韦燕飞,彭 岳,谢海源,等.基于肝星状细胞分子机制的抗肝纤维化研究进展〔J〕.世界华人消化杂志,2009;17(17):1745-8.

  (编辑 曹梦园)

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