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眼针对急性脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织脑源性神经因子表达的影响

首席医学网      2012年07月22日 13:58:20 Sunday  
 
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作者:王 哲 王德山 王 莹 马贤德 赵金茹 王守岩 关洪全    作者单位:(辽宁中医药大学,辽宁 沈阳 110032)

【摘要】  目的 探讨眼针治疗急性脑缺血再灌注损伤的机制。方法 应用线栓法复制急性脑缺血再灌注损伤大鼠模型,采用眼针治疗,于再灌注后3 h进行神经功能缺损评分,采用免疫组化、Western印迹、实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)方法测定脑组织脑源性神经因子(BDNF)蛋白及mRNA表达的变化。结果 与模型组比较,眼针组大鼠神经功能缺损评分明显下降,脑组织BDNF蛋白及mRNA表达明显上调(P<0.05)。结论 眼针具有明显改善大鼠脑缺血再灌注损伤的作用;其机制与上调脑组织BDNF表达有关。

【关键词】  眼针;急性脑缺血再灌注损伤;脑源性神经因子

  【Abstract】 Objective To investigate the effect of eye acupuncture therapy on cerebral brain-derived neurotrophic factor (BDNF) expression in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury and the related mechanism. Methods Rat model of cerebral ischemia-reperfusion was established by suture method. The methods of immunohistochemistry staining, Western-blotting and RQ-PCR were taken to detect the alteration of the BDNF protein and BDNF mRNA in rat brains after eye acupuncture therapy. Results Compared with the model group, the neurologic impairment score of the eye-acupuncture group was decreased obviously and the expression of the BDNF protein and BDNF mRNA in rat brains after eye acupuncture therapy was strongly increased(P<0.05). Conclusions Eye acupuncture therapy can reduce the cerebral ischemia-reperfusion injury evidently by increasing the expression of the cerebral BDNF protein.

  【Key words】 Eye acupuncture; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)

  缺血性脑血管病约占全部脑血管患者的70%~80%。脑缺血可诱导产生多种神经营养因子,它们可以与神经干细胞上的相应受体结合激活细胞内的信号系统,从而促进其分化,部分地替代和修复受损的神经元,从而在一定程度上改善神经功能缺损。脑源性神经因子(BDNF)在脑中分布广泛,其分布包括皮质、海马、基底前脑、纹状体、下丘脑和小脑,不仅分布于神经细胞体而且延伸到纤维,是脑中含量最多的神经营养因子,具有调节神经系统发育、成熟、维持神经元生长的功能。近来研究已表明BDNF在脑缺血再灌注损伤缺血周边区神经元的损伤修复中发挥了重要作用〔1〕。眼针疗法是我校著名老中医彭静山教授建立的微针疗法,对于多种疾病,特别是急性脑卒中效果尤为明显,但其治疗机制尚不清楚。本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,观察眼针对脑组织BDNF表达变化的影响,旨在探讨眼针治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制。

  1 材料与方法

  1.1 实验动物与分组

  健康SPF级SD大鼠32只,雌雄不拘,体重(280±20) g,由北京维通利华实验动物中心提供,许可证编号:SCXK(京)2007-0001。适应性喂养1 w,自由饮水、摄取标准颗粒饲料,室内温度22℃,相对湿度45%。按随机数字法将大鼠分为对照组、假手术组、模型组、眼针组4组,每组8只。

  1.2 模型制备与评价

  参照文献〔2〕,模型组及眼针组采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。模型成功标准:大鼠于缺血2 h后进行再灌注,再灌注后进行神经功能缺损评分,参照Longa 5分制评分标准〔3〕:0分为无症状;1分为不能完全伸展对侧前爪;2分为向对侧转圈;3分为向对侧倾倒;4分为不能自发行走,意识丧失。评分为1~3分者纳入实验组,未达标准者排除。假手术组术式同模型、眼针组,区别在于钓鱼线插入深度为0.5~1 cm。正常组未做处理。

  1.3 眼针取穴及刺法

  眼针组:用31号13 mm毫针,于大鼠眶周2 mm处针刺,定位参照人体取穴方法〔4〕,取肝区、上焦区、下焦区、肾区针刺。手法:平刺,进针3 mm。留针20 min,留针期间捻转行针3次,每次1 min。治疗时机:3 h眼针组于脑缺血再灌注即刻及取材前30 min分别进行眼针治疗2次。

  1.4 试剂及试药

  实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa大连宝生物。BDNF引物由北京华大基因公司合成。亲和纯化兔抗鼠BDNF多克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒及DAB染色试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

  1.5 指标测定

  脑组织BDNF蛋白表达(免疫组化SABC):断头取脑,置于4%多聚甲醛固定液中固定,常规脱水、石蜡包埋。将包埋的蜡块作5 μm切片,免疫组化按试剂盒操作。BDNF以细胞膜或细胞质内出现清晰棕褐色颗粒为阳性。使用BI2000医学图像分析系统对采集的图像测定阳性反应物的灰度。脑组织BDNF蛋白表达(Western印迹法):断头取右脑,按脑组织净重∶裂解液=1∶10的比例,加入相应体积的裂解液,PH值为7.5,将样品剪碎后匀浆、离心,上清即为总蛋白。兔抗鼠BDNF一抗(1∶500);O-dianidine,β-naphthyl acid phosphate显色;扫描仪扫描NC膜,分析结果。脑组织BDNF mRNA的表达:采用RQ-PCR方法:BDNF上游引物:5′ ATGGGTTACACGAAGGA 3′;下游引物:5′GCCCGAACATACGATT3′。β-actin为内参,其上下游引物分别为:5′CGTGCGTGACATTAAAGAG 3′,5′ TTGCCGATAGTGA TGACCT 3′。所有的产物,在ABI Prism 7500 HT序列检测系统中运行。读取CT 值,以管家基因β-actin 为内参。

  1.6 统计学处理

  采用SPSS11.5统计软件分析,实验数据均采用x±s表示,组间比较采用单因素方差分析。

  2 结 果

  2.1 眼针对急性脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠神经缺损评分影响

  模型组和眼针组大鼠均出现不同程度的神经功能障碍,如提尾时左侧前肢不能伸直,行走向对侧旋转或倾倒等;假手术组大鼠无神经功能障碍表现。模型组造模后即刻与眼针组造模后即刻及模型组再灌注损伤3 h后神经功能缺损评分无差异,眼针组再灌注损伤3 h后与造模后即刻神经功能缺损评分有差异(P<0.01)。见表1。

  2.2 眼针对脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠脑组织BDNF蛋白表达的影响

  图1、表2显示采用免疫组化方法检测结果:模型组右侧顶叶脑组织BDNF阳性细胞较正常组和假手术组减少,而眼针组BDNF阳性细胞较模型组增多,且阳性细胞体积较大且呈圆形、多角形,差异显著(P<0.01)。表1 眼针对脑缺血再灌注损伤3 h神经缺损评分影响图1 眼针对脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠脑组织BDNF表达影响(SABC,×400) 图2,表2为采用Western印迹方法检测结果:取大鼠右侧顶叶脑组织检测BDNF蛋白,以β-actin为内参,模型组脑组织BDNF蛋白表达明显低于正常组和假手术组,眼针组BDNF蛋白表达明显高于模型组(P<0.01)。

  2.3 眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织BDNF mRNA表达的影响

  采用实时定量PCR方法检测脑组织BDNF mRNA表达,本实验选用β-actin作为内参,BDNF基因扩增产物大小为86 bp,β-actin基因扩增产物为132 bp。模型组脑组织BDNF mRNA表达(0.46±0.16)较正常组、假手术组减少(1.03±0.18,1.04±0.24),眼针组表达(1.09±0.33)较模型组增高,均有显著差异(P<0.01)。表2 眼针对脑缺血再灌注损伤3 h后大鼠脑组织BDNF蛋白表达影响图2 眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织BDNF蛋白表达的影响(Western印迹法)

  3 讨 论

  随着人口老龄化程度的加剧,脑血管疾病已成为一个倍受社会关注的问题。脑缺血是脑血管疾病最主要的病种,在我国,其死亡率仅次于恶性肿瘤,是对人类健康威胁十分严重的一类疾病,所以在临床上如何减轻脑组织的损伤、保护神经细胞免受损伤成为研究的热点问题。BDNF是由Barde〔5〕等在1982年从猪脑中首先分离和纯化,属于神经生长因子家族成员,在维持神经元功能及其损伤后再生修复方面发挥着重要作用,体外及体内实验研究均证实BDNF在神经元存活、神经发生分化和增殖以及学习、记忆等方面扮演着重要的角色〔6〕。BDNF由神经细胞合成并广泛分布于中枢神经系统,以大脑皮质、海马、纹状体分布最为丰富。有研究表明,当机体发生脑缺血再灌注损伤后,其脑神经细胞的损伤程度与BDNF的表达水平密切相关,BDNF mRNA水平增强能够提高神经元的抗损伤能力〔7〕。通过本实验可观察到,模型组大鼠缺血侧脑组织BDNF mRNA和蛋白表达较正常组和假手术组下降,说明在脑缺血再灌注损伤早期就有BDNF表达的下降,加重了脑缺血再灌注损伤的程度,表现为模型组大鼠出现神经功能缺损。

  中医认为中中风治疗的各个时期均可采用针灸疗法,并取得肯定疗效〔8〕。人体经络直接或间接与眼相连。正如《灵枢·邪气脏腑 》曰:“十二经脉,三百六十五络,其血气皆上于面而走空窍,其经阳气上走于目而为睛。” 《灵枢 ·经脉 》曰:“诸脉皆属于目”。 眼与脏腑关系密切,眼的正常功能依赖五脏六腑之滋养。据此,我校著名老中医彭静山先生结合眼与经络、脏腑的关系,经过长期临床实践,创立了眼针疗法,在白睛脉络异常部位的眼眶内针刺治疗,常常收到奇效。另有研究结果表明眼针疗法对脑供血不足患者治疗效果确切显著,是一种简便有效、无不良反应、易于推广的疗法〔9〕。但是眼针治疗中风病等的机制是否与BDNF表达变化有关尚未见报道。

  本实验结果显示缺血再灌注损伤3 h眼针组BDNF的蛋白表达及基因表达均较模型组升高,同时眼针组大鼠神经功能缺损较模型组减轻,说明眼针刺激能上调病变侧脑组织BDNF的表达,减轻脑缺血再灌注损伤。表明眼针刺激肝区、肾区、上焦区、下焦区,可能是通过调节BDNF的表达来减轻脑缺血再灌注损伤的,其相关机制将继续研究。

【参考文献】
   1 刘 崴,程 焱,王 虔.脑源性神经营养因子与缺血性脑损伤〔J〕.国外医学·脑血管疾病分册,2004;12(6):433-6.

  2 马贤德,孙宏伟.线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究〔J〕.中华中医药学刊,2009;27(6):1200-1.

  3 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

  4 彭静山.眼针疗法〔M〕.沈阳:辽宁科学技术出版社,1990:11.

  5 Barde YA,Edgar D,Thoenen H.Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain〔J〕.J EMBO,1982;1:549-53.

  6 Marini AM,Jiang X,Wu X,et al.Preconditioning and neurotrophins:a model for brain adaptation to seizures,ischemia and other stressful stimuli〔J〕.Amino Acids,2007;32:299-304.

  7 Schabitz WR,Berger C,Kollmar R,et al.Effect of brain-derived neurotrophic factor treatment and forced arm use on functional motor recovery after small cortical ischemia〔J〕.Stroke,2004;35:992-7.

  8 田维柱.中华眼针〔M〕.沈阳:辽宁科学技术出版社,1998:78-88.

  9 李 志.眼针改善慢性脑供血不足患者认知功能障碍〔J〕.中国针灸,2009;29(10):791-3.

  (编辑 曹梦园)

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