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糖尿病大鼠肾组织中AKT的表达及意义

首席医学网      2012年07月22日 14:00:52 Sunday  
 
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作者:石明隽 肖 瑛 桂华珍 郭 兵 张国忠    作者单位:(贵阳医学院病理生理学教研室,贵州 贵阳 550004)

【摘要】  目的 观察Akt1和Akt2在糖尿病大鼠肾组织中的表达并探讨其是否参与糖尿病肾病(DN)发病过程。方法 链脲佐菌素(STZ)诱发大鼠糖尿病(DM),分为2、4、8、12、16 w和24 w组,每一时点均设相应的正常对照组。测定各组血糖、24 h尿蛋白、血肌酐(Scr)、肾脏指数。HE和PAS染色光镜观察肾脏病理改变。免疫组化方法检测肾皮质Akt1、Akt2、TGF-β1、α-SMA和FN的表达,Western印迹和RT-PCR法检测Akt1、Akt2蛋白及mRNA表达水平。结果 DM各组大鼠的血糖、24 h尿蛋白、血肌酐、肾脏指数均较正常对照组明显升高(P<0.05,P<0.01),免疫组化显示DM各组TGF-β1、α-SMA和FN阳性染色较正常组明显增多(P<0.01),以12 w增多最为明显,分别为19.67±2.73、9.50±3.45、22.17±2.79,免疫组化、Western印迹及RT-PCR显示DM各组Akt1及Akt2蛋白和mRNA表达较正常组明显增多(P<0.01)。免疫组化显示Akt1与TGF-β1、FN蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.694,r=0.532,P<0.01),Akt2与TGF-β1、FN蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.789,r=0.743,P<0.01)。结论 Akt1、Akt2蛋白在DM大鼠肾组织过度表达,提示PI3K/Akt信号通路可能参与了DN的发病机制。

【关键词】  Akt1;Akt2;转化生长因子β1;α-平滑肌肌动蛋白;纤连蛋白;糖尿病肾病

  【Abstract】 Objective To observe the expression of Akt1 and Akt2 in renal tissues of diabetic rats and explore its effect in the development of diabetic nephrophy. Methods The diabetic rats induced by streptozotocin (STZ) were randomly divided into 2, 4, 8, 12, 16 and 24 w groups. Control group was installated at age-matched time points. Blood glucose, 24 h urine protein, serum creatinine (Scr) of rats were measured. The protein expression of Akt1, Akt2, TGF-β1, α-SMA and FN in renal cortex were detected by immunohistochemical staining. Western blotting and reversetranscriptase-PCR (RT-PCR) were employed to detect the protein and mRNA expression of Akt1 and Akt2. Results The levels of blood glucose, 24 h urine protein and Scr were increased remarkably in diabetic rats compared with those in control groups (P<0.05, P<0.01). The protein and mRNA of Akt1 and Akt2 were significantly up-regulated. The TGF-β1, FN and α-SMA protein were significant increased in DM rats as compared with those of the controls. Conclusions Akt1 and Akt2 gene and protein expression are up-regulated in the kidney of DM rats, and which may involve in the pathogenesis of diabetic nephropathy.

  【Key words】 Akt1; Akt2; TGF-β1; α-SMA; Fibronectin; Diabetic nephropathy

  PI3K/Akt通路是细胞内重要的信号转导系统,广泛存在于细胞中,参与细胞的生长、增殖和分化调节。Akt是该信号通路的中心环节, Akt有Akt1、Akt2、Akt3三个亚型,其中Akt1和Akt2在人体各组织中普遍表达。肾小管-间质纤维化是所有慢性肾脏疾病包括糖尿病肾病(DN)进展至终末期肾功能衰竭的共同通路,许多细胞内信号转导机制参与了其发展过程。彭红霞等研究发现PI3K/Akt信号通路参与了单侧输尿管梗阻大鼠梗阻肾间质纤维化过程〔1〕。Jana等人研究显示在1型DM肾皮质Akt总蛋白表达水平未见变化〔2〕,在2型DM时肾皮质PI3K/Akt 信号通路被激活,Akt总蛋白表达水平增加〔3〕。然而DM时肾组织Akt亚型的表达和意义有待进一步阐明。为此,我们以1型糖尿病大鼠为对象,动态观察肾小管间质中Akt1、Akt2、TGFβ1、α-SMA和FN的表达情况,初步探讨PI3K/Akt信号通路在DN发生发展中的作用。

  1 材料与方法

  1.1 动物

  SD大鼠,雄性,体重(180~200)g,上海西普尔-比凯实验动物有限公司提供〔许可证号:Scxy(沪)2003-0002〕。

  1.2 主要试剂

  链脲佐菌素(STZ,Sigma),兔抗大鼠Akt1、Akt2、TGFβ1、FN多克隆抗体、小鼠抗大鼠α-SMA单克隆抗体、羊抗兔或小鼠IgG-HRP、免疫组化SABC检测试剂盒、DAB显色试剂盒、ECM化学发光试剂盒(武汉博士德公司),PVDF膜(美国Minipore公司),RNAsimple Total RNA KIT(北京天根公司),ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(美国Fermentas公司),Akt1、Akt2和β-actin引物合成(上海捷瑞)。

  1.3 动物模型及分组

  72只大鼠随机分成糖尿病2、4、8、12、16 w和24 w组(n=6),并设置相应时点的正常对照组(n=6)。糖尿病组予以尾静脉注射STZ 55 mg/kg,72 h后测血糖,血糖≥16.7 mmol/L者入选。正常对照组予以尾静脉注射STZ溶媒(枸橼酸缓冲液)。所有大鼠予标准饲料喂养,自由饮水,于处死前1 d用代谢笼收集24 h尿测尿蛋白。股动脉取血,测血糖和血肌酐,处死大鼠秤取双侧肾脏重量,以肾重(mg)与体重(g)比值作为肾脏指数。一侧肾于4%多聚甲醛固定用于病理及免疫组化染色,另一侧肾于-80℃保存用于蛋白印迹和RT-PCR检测。

  1.4 生化指标的测定

  氧化酶法测血清中的葡萄糖浓度,考马斯亮蓝方法检测尿蛋白,苦味酸方法测血清中的肌酐浓度,均按试剂盒说明书操作。

  1.5 肾组织病理检查

  多聚甲醛固定之肾组织制成3 μm石蜡切片,行HE、PAS染色,光镜下观察肾组织形态结构。

  1.6 免疫组化

  采用SABC法检测肾组织中Akt1、Akt2、TGFβ1、α-SMA、FN表达,一抗工作浓度均为1∶100。PBS代替一抗,作阴性对照。每张切片从肾皮质外侧向内,自上向下随机取10个高倍视野(×400),以肾小管细胞胞浆及(或)胞核内出现棕褐色颗粒为阳性信号,计数阳性染色的肾小管数,取均值表示Akt1、Akt2、TGFβ1和α-SMA表达程度。FN的表达则参考郭兵等〔4〕文献的方法进行计数,以10个高倍镜视野下的阳性点数取均值。

  1.7 Western印迹

  取-80℃保存的肾皮质100 mg,加裂解液匀浆,离心取上清测定蛋白含量,每泳道加50 μg蛋白质,经SDS-PAGE垂直凝胶电泳后,电转移至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的TBS室温封闭2 h,TBST洗膜后加Akt1抗体(1∶200)、Akt2抗体(1∶200),4℃孵育过夜;洗膜后加羊抗兔IgG-HRP室孵育2 h,TBST洗膜后用ECL试剂按说明曝光显影。 将孵育 一抗的膜用抗体剥脱液剥脱后,按同样的方法与β-actin抗体(1∶500)孵育,二抗用羊抗小鼠IgG-HRP。用BOI-RAD Chemo Doc XRS凝胶成像系统及Qantity One软件进行图像分析。以β-actin蛋白条带作内参照,计算Akt1和Akt2蛋白与β-actin蛋白条带灰度的比值为Akt1和Akt2蛋白表达的相对水平。

  1.8 RT-PCR检测Akt1和Akt2 mRNA表达

  取50~100 mg肾皮质加入1 ml Trizol,匀浆器冰上充分匀浆,按RNAsimple Total RNA KIT说明提取总RNA,核酸蛋白分析仪检测RNA浓度,按照Re vertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明合成cDNA。PCR的引物序列Akt1上游引物5′-AATACCTGGTGTCGGTCTCA-3′、下游引物5′-TCGAGCTCATCCTAATGGAG-3′; Akt2上游引物5′-ATGGTAGC CAACAGTCTGAAGC-3′、下游引物5′-TTGCCGAGGAGTTTGAGATAAT-3′;β-actin上游引物5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGA-3′、下游引物5′-GAAATCGTG CGTGACATTAAG-3′。反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,退火30 s(Akt1退火温度61.5℃,Akt2退火温度63℃,β-actin 57.4℃),72℃延伸30 s,Akt1循环30次、Akt2循环34次、β-actin循环30次后72℃充分延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统和Quantity one 软件进行图像分析。以β-actin作内参照,计算β-catenin与β-actin灰度比值表示其mRNA相对表达量。

  1.9 统计学处理

  实验结果以x±s表示,采用SPSS11.0统计软件包进行单因素方差分析,Pearson法进行相关分析,检验水准取α=0.05。

  2 结 果

  2.1 生化指标测定结果

  糖尿病组各时点的血糖维持在稳定的高水平,24 h尿蛋白、血肌酐、肾脏指数均从2 w开始显著升高,与正常对照组大鼠相比有显著性差异(P<0.01,P<0.05),见表1。表1 各组大鼠血糖、24 h尿蛋白、血肌酐、肾脏指数

  2.2 肾组织病理变化

  HE和PAS染色见正常大鼠肾小球及肾小管结构清晰,肾小管上皮细胞排列整齐,基底膜完整,间质中未见细胞浸润。DM组大鼠4 w后可见肾小管上皮细胞变性,部分肾小管腔内有细胞和管型,肾小管管腔扩张,上皮细胞萎缩,间质有较多细胞浸润,肾小管基底膜不规则增厚,肾小管-间质内紫红色染色物明显增多。

  2.3 免疫组化结果

  Akt1和Akt2在正常组大鼠和DM组肾小球未见表达,在正常组肾小管上皮细胞胞浆有少量表达,DM组大鼠肾小管上皮细胞胞浆表达明显增多。正常对照组大鼠无TGF-β1 蛋白表达,DM各组大鼠肾小球和肾小管可见TGF-β1阳性染色。正常大鼠α-SMA只在血管壁表达,DM大鼠从2 w开始肾间质细胞胞浆内有α-SMA阳性染色,8 w可见部分肾小球系膜细胞胞浆阳性染色,16 w时部分DM大鼠肾小管上皮细胞胞浆内可见阳性表达,并随病程延长细胞阳性染色增多。正常组大鼠肾间质无FN阳性表达,肾小管基底膜可见FN线性表达,DM组大鼠肾小管-间质FN表达从2 w开始逐渐增多,与对照组比较差异有显著性,见表2、图1。

  2.4 Western印迹结果

  Western印迹显示,正常对照组大鼠肾皮质可见Akt1和Akt2蛋白少量表达,DM各组大鼠Akt1和Akt2蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性,并随DM病情进展持续在高水平。见表3,图2。

  2.5 RT-PCR结果

  正常对照组大鼠肾皮质可见Akt1和Akt2 mRNA少量表达,DM组大鼠2 w开始Akt1和Akt2蛋白表达增加,随DM病情进展持续在高水平,与正常对照组相比差异有显著性。见表4,图3。

  2.6 相关性分析

  免疫组化结果显示,Akt1与TGF-β1、FN蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.0.694,r=0.532,P<0.01),Akt2与TGF-β1、FN蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.789,r=0.743,P<0.01)。表2 各组大鼠肾小管Akt1、Akt2、TGF-β1、α-SMA、FN免疫组织化学阳性表达  图1 正常组和DM组16 w时Akt1、Akt2蛋白表达(DAB,×400)C为正常对照组,2 w、4 w、8 w、12 w、16 w和24 w分别为DM各组 图2 Western印迹结果显示各组大鼠肾皮质Akt1和Akt2蛋白表达水平表3 Western印迹显示各组大鼠肾皮质Akt1和Akt2蛋白表达水平表4 RT-PCR显示各组大鼠肾皮质Akt1和Akt2 mRNA表达水平图3 各组大鼠肾皮质Akt1和Akt2 mRNA表达水平

  3 讨 论

  PI3K/Akt是细胞内重要的信号转导系统,当细胞受生长因子等刺激因子刺激后,细胞内PI3K 活化,使4、5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)转化为3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3),并与其下游分子Akt 结合使Akt活化,活化的PI3K/Akt参与细胞增生、分化、移行等的调节〔5,6〕;本研究免疫组织化学和Western印迹观察到DM大鼠从2 w起肾小管Akt1和Akt2表达增多,并在整个病程期间持续高表达,与 mRNA检测结果一致。提示在糖尿病动物肾小管上皮细胞中Akt在转录水平发生改变,其变化可能与高血糖有关〔7〕,且Akt1和Akt2增高幅度相似。

  肾小管间质纤维化是多种慢性进展性肾脏疾病包括DN发展至终末期肾功能衰竭的共同通路,其病理特征为正常的肾小管和肾间质被大量聚集的细胞外基质所代替。在肾间质纤维化中,均有细胞外基质(ECM) 的堆积,同时肾小管上皮细胞转分化(EMT)在肾小管间质纤维化过程中发挥重要作用。TGF-β1可通过多个信号通路介导肾小管上皮细胞转分化过程,并对间充质细胞和成纤维细胞有促生存作用,从而引起细胞间基质蛋白分泌增加〔5~7〕。肌成纤维细胞能够分泌大量的胶原和纤维连接蛋白,使细胞外基质沉积,而α-SMA是其标志性蛋白。本实验免疫组化结果显示正常对照组大鼠肾小管上皮细胞无TGF-β1蛋白表达,DM各组大鼠中肾小球和肾小管可见TGF-β1阳性染色,同时DM大鼠从2 w开始在肾间质细胞胞浆内有α-SMA阳性染色,16 w时部分DM大鼠肾小管上皮细胞胞浆内可见阳性表达,并随病程延长细胞阳性染色增多,与TGF-β1表达增加一致,提示在DM大鼠肾组织中有成纤维细胞活化和肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞表型转变,且这种表型转变可能为TGF-β1所介导。同时我们还观察到随着病程发展,肾小管间质区FN增多,与α-SMA增加相一致,提示DM大鼠肾小管间质ECM成分FN沉积增多可能部分来源于肌成纤维细胞。

  有研究显示PI3K/ Akt信号通路参与了TGF-β1介导的肾小管上皮细胞转分化过程〔8,9〕。TGF-β1可激活PI3K/Akt信号通路,促使其下游转录因子转录,使蛋白合成增加,肾脏肥大和ECM沉积,促进肾小管间质纤维化从而引起DN的发生。本研究相关性分析显示,Akt1与TGF-β1、FN的表达水平呈正相关(r=0.694,r=0.532,P<0.01),Akt2与TGF-β1、FN的表达水平呈显著正相关(r=0.789,r=0.743,P<0.01),提示在DN时Akt1和Akt2可能参与了TGF-β1介导的大鼠肾小管上皮细胞转分化过程,从而促进了DN的发生发展。

【参考文献】
    1 彭红霞,陈 明,张 超,等.单侧输尿管结扎对大鼠肾间质PI3K/AKT表达的影响〔J〕.基础医学与临床,2006;26(12):1345-9.

  2 Zdychova J,Vesela J,Kazdova L,et al.Renal activity of Akt kinase in experinebtal type Ⅰ diabetes〔J〕.Physiol Res,2008;57:709-15.

  3 Zdychova J,Ludmila K,Terezie P,et al.Renal activity of Akt kinase in Obese Zucker rats〔J〕.Exp Biol Med,2008;233:1231-41.

  4 郭 兵,肖 瑛,万昌武,等.糖尿病大鼠肾小管TGF-β1和MAPK1/3表达的动态观察〔J〕.中国病理生理杂志,2004;20(9):1681-5.

  5 Xu G,Zhang W,Betram P,et al.Pharmacogenomic profiling of the PI3K/PTEN-AKT-mTOR pathway in common human tumors〔J〕.Int J Oncol,2004;24(4):893-900.

  6 Gao N,Zhang Z,Jiang BH,et al.Role of PI3K/AKT/mTOR signaling in the cell cycle progression of human prostate cancer〔J〕.Biochem Biophys Resommun,2003;310(4):1124-32.

  7 Horowitz JC,Lee DY,Waghray M,et al.Activation of the pro-survival phosphatidylinositol 3-kinase/ AKTpathway by transforming growth factor-beta1 in mesenchymal cells is mediated by p38 MAPK-dependent induction of an autocrine growth factor〔J〕.J Biol Chem,2004;279(2):1359-67.

  8 张 勇,张 景.PI3K的激活在TGF-β1诱导肾小管上皮细胞间质转分化过程中的作用〔J〕.解放军医学杂志,2006;31(6):553-5.

  9 Jayesh JK,Rosemarie MC,Mediha H,et al.Protein kinase B/Akt activity is involved in renal TGF-β1-driven epithelial-mesenchymal transition in vitro and in vivo〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2008;295:215-25.

  (编辑 曹梦园)

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