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复方地黄方对帕金森病左旋多巴模型大鼠GDNF变化的影响

首席医学网      2012年07月22日 13:56:38 Sunday  
 
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作者:丁宏娟 何建成 罗瑞静 张晨光    作者单位:(上海中医药大学基础医学院,上海 201203)

【摘要】  目的 探讨复方地黄方对帕金森病左旋多巴(LD)毒副反应大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)变化的动态影响。方法 采用经典的6-OHDA脑立体定向注射术建立大鼠PD模型,在此基础上腹腔注射2 w LD制备毒副反应模型(简称LD模型)。把成功的LD模型分为LD模型组和复方地黄方组,同时纳入正常对照组和假手术组、PD模型对照组,每组18只。每组在2 w、4 w、6 w不同时间点,应用免疫组化方法观察各个时间点纹状体GDNF的表达。结果 ①从同一时间点来看,LD模型组、PD模型对照组和复方地黄方组GDNF表达均低于各个时间点的正常对照组和假手术组(P<0.01,P<0.001);复方地黄方组GDNF表达均高于各个时间点的LD模型组和PD模型对照组(P<0.001);LD模型组GDNF表达均低于各个时间点的PD模型对照组(P<0.01,P<0.001)。②从不同时间点来看,随着时间的延长,LD模型组GDNF表达呈不断减少趋势,治疗6 w与治疗2 w、4 w比较差异有统计学意义(P<0.001);复方地黄方组GDNF表达呈不断增加趋势,治疗6 w与治疗2 w、4 w比较差异均有统计学意义(P<0.001);PD模型对照组的表达在各时间点差异无统计学意义(P>0.05)。结论 复方地黄方能明显增加帕金森病LD模型大鼠纹状体GDNF的表达,减少多巴胺神经元的死亡,从而减轻LD的毒副反应。

【关键词】  复方地黄方;帕金森病;左旋多巴大鼠;GDNF

  【Abstract】 Objective To approach the effect of compound rehmannia prescription on the expression of GDNF in LD rats with Parkinson′s disease(PD).Methods The classic method was used to establish the PD model rats through stereotoxic injection of 6-OHDA,then injected intraperitoneally Levodopa/benserazide for 2 w to establish the model of rats with toxic and side effects of Levodopa in PD(to call LD model for short). The successful LD models were randomized into LD model and compound rehmannia prescription groups,and normal control, sham-operated and PD model control groups were brought into,18 rats for each group.Then, the expression of GDNF in striatum by immunohistochemistry in different time were observed about 2, 4, 6 w. Results ①From the same time, the expression of GDNF in LD model, compound rehmannia prescription and PD model control groups were lower than those of normal control and sham-operated groups(P<0.01,P<0.001); and it was higher in compound rehmannia prescription group than that of LD model and PD model control groups(P<0.001); and it was lower in LD model group than that in PD model control group(P<0.01,P<0.001).②From the different time,with the time by, the expression of GDNF was gradually decreased in LD model group, and there was significant difference at 6 w compared with that at 2 w,4 w(P<0.001);but the expression of GDNF in compound rehmannia prescription group was gradually increased, and there was significant difference at 6 w compared with that at 2 w,4 w(P<0.001); PD model control group was no significant(P>0.05). Conclusions Compound rehmannia prescription could obviously increase the expression of GDNF in striatum of LD rats with PD, and reduce the DA neuron death, to lighten the toxic and side effects of Levodopa.

  【Key words】 Compound rehmannia prescription;Parkinson′s disease;LD rat;GDNF

  胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是目前帕金森病(PD)研究中最受关注的神经营养因子之一,其对多巴胺神经元有高度的亲合力,能产生特异性的保护作用〔1〕。晚近的研究表明,中医药在PD的治疗及毒副反应的缓解方面疗效显著〔2〕。本实验观察了复方地黄方对左旋多巴(LD)模型大鼠纹状体GDNF的动态干预作用,探讨复方地黄方缓解LD毒副反应的机制,为中医药治疗PD及减轻毒副反应提供实验依据。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 动物实验及条件

  动物:SD大鼠,150只,SPF级,雄性,体重180~200 g,由上海中医药大学实验动物中心提供,许可证号:SYXK(沪)2004-0005。实验条件:动物饲养在上海中医药大学实验动物中心,恒温(20±2)℃,自动光-暗控制(LD12∶12,即07∶00~19∶00 光照,19∶00~07∶00 暗置),相对湿度60%~65%,动物摄食饮水自由。

  1.1.2 药物

  戊巴比妥钠,上海中西药业股份有限公司;LD干粉、苄丝肼,美国Sigma公司;庆大霉素,上海第一制药厂,0.3 g/支。中药复方地黄方:熟地黄15 g,白芍30 g,钩藤15 g,珍珠母15 g,丹参20 g,石菖蒲12 g,全蝎2 g,绿茶6 g。

  1.1.3 试剂

  6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、阿扑吗啡(apomorphine,APO)、抗坏血酸均为美国Sigma公司产品;GDNF抗体为Santa Cruz公司产品;即用型快捷免疫组化Max VisionTM试剂盒(鼠)、抗原修复液、PBS、DAB显色试剂盒均为迈新生物技术有限公司产品。

  1.1.4 仪器

  大鼠脑立体定位仪:TOW-3A型;大鼠脑立体定位仪:TOW-3A型,汕头市教育医学仪器厂;微量进样器(5 μl):上海第三分析仪器厂;旋涡混合器:XW-80A,上海医科大学仪器厂;分析天平:Sartorius anglytic,910324;秒表:上海秒表厂,926266;石蜡切片机:CUT4060石蜡切片机;石蜡包埋机:YB-6LF生物组织石蜡包埋机;湿盒:迈新生物技术有限公司产品。

  1.2 模型制备方法

  采用经典、公认的Ungerstedt等创立的方法。术前按常规进行行为测试,确认无异常旋转行为后,用3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。然后将大鼠固定于脑立体定位仪上,头部去毛,苯扎溴铵(商品名:新洁尔灭)常规消毒。无菌条件下,沿正中线切开大鼠颅顶皮肤,剥离骨膜,暴露前囟。以前囟为准,根据包新民等著大鼠脑立体定位图谱,确定右侧黑质二坐标:①前囟后5.2 mm,正中线右侧1.0 mm,硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm,正中线右侧2.5 mm,硬膜下8.5 mm。用颅骨钻于手术部位小心钻开颅骨,用5 μl微量进样器将6-OHDA(溶于含0.02%维生素C的生理盐水中,即秤量抗坏血酸0.001 g,溶于生理盐水5 ml中)注入右侧黑质部(以1.0 mm/min速度缓慢进针),每孔3 μl,注射速度为1 μl/min,注射完毕后留针5 min,然后以1.0 mm/min速度缓慢退针。手术完成后,用医用可吸收性明胶海绵填塞颅骨孔,缝合切口皮肤,肌肉注射庆大霉素7 d,待动物清醒后放回饲养笼中饲养。假手术组只注射含0.02%维生素C的等量生理盐水,其余条件与造模手术相同;正常对照组只固定大鼠,不进行任何处理。10 d后,以腹腔注射APO 0.5 mg/kg诱发大鼠向一侧旋转,记录开始旋转至30 min内的旋转圈数,以旋转圈数平均>7次/min者为合格的PD模型〔3〕。将成功的部分PD模型大鼠给予腹腔注射LD/苄丝肼(50 mg/kg LD和12.5 mg/kg苄丝肼,即LD和苄丝肼溶于含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的注射用水中,配成10 mg/ml),每日2次(分别为上午9时和下午5时),连续2 w。正常对照组、假手术组、部分PD模型大鼠给予腹腔注射等量的含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的注射用水,亦每日2次,连续2 w。2 w后诱发动物,具有典型异常不自主动作(abnormal involuntary movement,AIM)表现,且APO诱导大鼠对侧旋转圈数增加者为合格的LD模型大鼠〔4〕。

  1.3 分组及给药

  采用区层随机法,将成功LD大鼠随机分为2组:LD模型组、复方地黄方组(复方地黄方+LD),每组18只。另取正常对照组、假手术组和PD模型对照组,每组18只。LD模型组大鼠在腹腔注射左旋多巴/苄丝肼(50 mg/kg LD和12.5 mg/ml苄丝肼)的基础上给予生理盐水灌胃;复方地黄方组大鼠在腹腔注射LD/苄丝肼的基础上给予复方地黄方中药灌胃;正常对照组、假手术组和PD模型对照组给予腹腔注射等量的含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的注射用水的基础上给予生理盐水灌胃。每次灌胃量为2 ml,1次/d。

  1.4 GDNF免疫组化检测方法

  1.4.1 组化取材及样品制备

  各组大鼠测试完毕后,每组不同时间点(2 w、4 w、6 w)各取6只动物按3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉,进行心脏灌注和取样。(1)先将灌注针头由左心室心尖部插入升主动脉,剪开右心耳。(2)先灌注生理盐水500 ml,至液体不见血色为止,接着灌注4%多聚甲醛PBS液体约500 ml,见动物出现四肢抽搐。(3)动物四肢末端及尾尖变硬时,表示灌注完成。(4)分离纹状体部分,修块后置上述灌注液中固定过夜。(5)石蜡包埋切片,片厚5 μm。

  1.4.2 GDNF检测方法

  (1)石蜡切片常规脱蜡和水化。(2)PBS(pH7.4)冲洗3次,每次5 min。(3)采用柠檬酸抗原修复液煮沸,对组织进行抗原修复。(4)PBS(pH7.4)冲洗3次,每次5 min。(5)除去PBS液,每张切片滴加50 μl一抗(工作浓度1∶50),4℃过夜,(6)PBS(pH7.4)冲洗3次,每次5 min。(7)每张切片滴加一滴增强液A液,37℃反应20 min,PBS(pH7.4)冲洗3次,每次5 min。(8)除去PBS液,每张切片滴加一滴二抗B液,37℃反应30 min,PBS(pH7.4)冲洗3次,每次5 min。(9)除去PBS液,每张切片滴加100 μl新鲜配制的DAB溶液,显微镜下观察显色1~2 min。(10)自来水冲洗终止反应,苏木素复染,自来水冲洗返蓝,盐酸酒精分化。(11)梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封固。(12)阴性对照一抗用PBS代替,其余步骤按以上操作。(13)镜下观察。在2 w、4 w、6 w三个不同时间点,每组观察6张切片,每张切片在光镜高倍镜下随机取3个4 mm2视野,计算GDNF阳性反应细胞。分析软件使用IMS彩色图像分析系统软件。

  1.5 统计学分析

  所有资料均用x±s表示,采用SPSS13.0软件进行齐性检验并做t检验和方差分析。

  2 结 果

  2.1 各组两侧纹状体的GDNF阳性细胞变化

  GDNF阳性信号定位于胞质。在正常对照组、假手术组的纹状体中均可见密集的GDNF阳性细胞,呈棕褐色或棕红色,胞体多为圆形或锥体形,呈散在分布,左右两侧的细胞数目相近。LD模型组、PD模型对照组及复方地黄方组损毁对侧(左侧)仍可见密集的GDNF阳性细胞;LD模型组损毁侧(右侧)纹状体可见少量、稀疏GDNF阳性细胞,且随着LD用药时间的延长,阳性细胞的表达数逐渐减少;PD模型对照组损毁侧(右侧) 黑质也可见少量、稀疏GDNF阳性细胞,呈棕褐色,在各时间点差异不明显;复方地黄方组损毁侧(右侧)仍可见较密集的GDNF阳性细胞,呈棕褐色,且随着时间的递增阳性细胞数目表达呈递增趋势。

  2.2 复方地黄方干预后LD大鼠纹状体GDNF的动态变化

  LD模型组、PD模型对照组和复方地黄方组GDNF的表达均低于各个时间点的正常对照组和假手术组(P<0.01,或P<0.001);与LD模型组比较,PD模型对照组和复方地黄方组GDNF表达均明显升高(P<0.01或P<0.001);与PD模型对照组比较,复方地黄方组GDNF表达升高,在4 w、6 w时,差异有统计学意义(P<0.001)。随着时间的延长,LD模型组GDNF表达呈不断减少趋势,治疗6 w与治疗2 w、4 w比较,差异均有统计学意义(P<0.001);PD模型对照组的表达在各时间点差异无统计学意义(P>0.05);复方地黄方组GDNF表达呈不断增加趋势,治疗6 w与治疗2 w、4 w比较,差异亦均有统计学意义(P<0.001)。见表1。表1 复方地黄方对LD大鼠纹状体GDNF表达的影响

  3 讨 论

  PD模型中GDNF的含量减少〔5,6〕,本研究发现,PD模型对照组在不同时间点,GDNF表达均明显低于正常对照组和假手术组,与文献报道一致。同时本研究提示一定剂量LD的蓄积可影响纹状体神经元和黑质残存细胞神经营养因子的产生,具有神经毒性作用,而且随着使用时间的延长,其毒副反应越明显。

  研究表明〔7~9〕,GDNF对多巴胺能神经元有明显的营养与促存活作用。有人曾通过基因转导的方式将酪氨酸羟化酶及营养因子基因导入大鼠纹状体内,发现可有效改善PD的症状〔10〕。本研究结果提示复方地黄方可通过升高GDNF的表达,有效改善PD症状,并对多巴胺神经元起到保护作用。

  中医学认为,PD的病理性质总属本虚标实,本虚为肝肾亏损,脏腑功能失调;标实为风、毒、痰、瘀互结,蕴塞脑窍。治宜滋肾补肝,平肝熄风,化痰活血,解毒散结〔11〕。复方地黄方便是基于此理论而成的中药复方,由熟地黄、钩藤、珍珠母、丹参、全蝎等组成。目前认为GDNF的神经保护作用与以下几个方面有关:(1)通过维持Ca2+平衡,加强抗自由基能力,抵抗自由基损害〔12〕;(2)通过提高能分解H2O2的酶系统以及阻止神经纤维对神经毒性物质的吸收来对抗自由基损害〔13〕。前期研究表明,复方地黄方能明显改善PD 模型大鼠的旋转行为,提高其抗氧化能力和清除自由基的能力〔14〕。提示复方地黄方能增加GDNF表达,通过抗氧化应激、自由基反应途径,对DA神经元起到营养和保护作用,减少DA神经元的死亡。详细机制尚待进一步研究。

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  (编辑 徐 杰)

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