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疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织LXRα mRNA及蛋白表达的影响

首席医学网      2012年07月22日 13:59:54 Sunday  
 
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作者:杨钦河 王文晶 冯高飞 何秀敏 张玉佩 纪桂元 胡四平 王彦平 陈同炎 刘海涛 闫海震 黄 进    作者单位:(暨南大学医学院,广东 广州 510632)

【摘要】  目的 探讨疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝组织LXRα mRNA及蛋白表达的影响。方法 选用SD大鼠55只,随机分为正常组、模型组、疏肝组(灌服3.2 g·kg-1·d-1剂量的柴胡疏肝散)、健脾组(灌服10.0 g·kg-1·d-1剂量的参苓白术散)、综合组(灌服11.9 g·kg-1·d-1剂量的柴胡疏肝散和参苓白术散合方),模型组15只,其余各组10只。采用灌饲高脂肪乳剂(10 ml/kg)的方法复制大鼠NAFLD实验动物模型,给药8 w后处死动物,腹主动脉采血,用全自动生化分析仪检测血脂及肝功;常规HE染色观察肝组织病理变化;RT-PCR方法检测肝组织LXRα mRNA的表达;免疫组织化学方法检测肝组织LXRα蛋白的表达。结果 与正常组相比,模型组大鼠肝细胞脂肪变性明显,血脂及肝功均有不同程度的升高(P<0.05,P<0.01),大鼠肝组织LXRα mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.01);各给药组血脂及肝功和肝组织LXRα mRNA及蛋白的表达均较模型组显著降低(P<0.05,P<0.01),其中以健脾组下降最为明显。结论 疏肝健脾方药对高脂饮食诱导的大鼠NAFLD有较好的治疗作用,其机制可能与其下调肝脏LXRα的表达有关。

【关键词】  非酒精性脂肪性肝病;疏肝健脾方药;肝X受体α基因;大鼠

  【Abstract】 Objective To investigate the effects of soothing liver and invigorating spleen recipes on the expression of LXRα mRNA and protein in hepatic tissue of rats with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Methods 55 male SD rats were randomly divided into 5 groups: normal, model, soothing liver (receiving gavage of Chaihu Shugan Powder 3.2 g·kg-1·d-1), invigorating spleen (receiving gavage of Shen Ling Baizhu Powder 10.0 g·kg-1·d-1) and integrated groups (receiving gavage of Chaihu Shugan Powder and Shen Ling Baizhu Powder combination recipes11.9 g·kg-1·d-1). 15 rats were in model group and 10 rats were in each of the other groups. Except the normal group, the rats in other groups were fed with high-fat emulsion by gastric perfusion (10 ml/kg) besides basic diet to induce NAFLD. After treatment for 8 weeks, the rats were executed to obtain blood samples from aortaventralis. The contents of TC, TG, ALT, AST in the serum, as well as TC, TG in the hepatic homogenate were detected by automatic biochemical analyzer. The histopathological changes of hepatic tissue were observed by HE staining. The expression levels of LXRα mRNA in liver tissue were analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The expression of protein LXRα in the hepatic tissue was examined by immunohistochemistry. Results Compared with normal group, there were revealed medium fatty degeneration in hepatocytes in model group;the serum TC, TG, ALT, AST levels and the liver levels of TC and TG in model group were increased in different degree (P<0.05, P<0.01);the expression of LXRα mRNA and protein in the hepatic tissue were dramatically increased (P<0.01). Compared with the normal group, the serum TC, TG, ALT, AST levels and the liver levels of TC, TG and the expression of LXRα mRNA and protein in each treatment group were decreased in different degree (P<0.05, P<0.01), especially in the invigorating spleen group. Conclusions Soothing liver and invigorating spleen methods and recipes show certain therapeutic effect on rats with NAFLD, which may be due to down-regulating expression of the liver LXRα mRNA and protein in hepatocyte.

  【Key words】 Non-alcoholic fatty liver disease; Soothing liver and invigorating spleen methods and recipes; Liver X receptor α; Rats

  非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)作为一种遗传-环境-代谢应激相关性肝病,其发病率及检出率日益增高,并呈现低龄化趋势,在我国亦已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病〔1,2〕。各种原因引起脂质代谢自稳的破坏造成脂质在肝内大量异常蓄积是NAFLD发病机制中最关键、最基础的环节之一。肝脏脂质代谢的调控机制十分复杂,近年来研究表明〔3,4〕,LXRα在肝脏中表达最多,参与了肝脏中脂肪的形成,胆固醇的吸收、转运、代谢,血糖水平及炎性因子的调节,是脂质代谢通路的关键信号转导因子,其调控功能异常可能成为多种代谢性相关疾病的共同病理生理基础〔5〕,因此研究LXRα在NAFLD脂质代谢紊乱中的作用进而揭示NAFLD的发病机制颇有意义。以往的研究发现,疏肝健脾方药对NAFLD有良好的防治作用〔6~9〕,本实验从脂质代谢的角度入手,研究LXRα在NAFLD发病中的作用,旨在进一步探讨疏肝健脾方药治疗NAFLD的分子机制,为NAFLD的中医药治疗提供实验依据。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 实验动物

  SPF级健康雄性SD大鼠55只,体质量(180±15)g,购于广东省医学实验动物中心,实验动物许可证号:SCXK(粤)2008-0002;粤监证字:2008A020。分笼饲养于室温22℃~26℃,相对湿度60%~80%,明暗各12 h的动物实验室内。

  1.1.2 实验用药

  ①疏肝方(柴胡疏肝散:柴胡6 g,川芎5 g,枳壳5 g,陈皮6 g,白芍5 g,香附5 g,炙甘草3 g);②健脾方(参苓白术散:人参15 g,白术15 g,茯苓15 g,薏苡仁9 g,砂仁6 g,山药15 g,桔梗6 g,白扁豆12 g,莲子9 g,炙甘草9 g);③综合方(柴胡疏肝散与参苓白术散合方)。上述药物均为深圳华润三九医药股份有限公司中药配方颗粒剂,购自暨南大学附属第一医院中药房。疏肝方及健脾方组成、剂量均参考第六版《方剂学》教材〔10〕,综合方乃柴胡疏肝散与参苓白术散的合方。

  1.1.3 主要试剂

  Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品;RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit为美国Fermentas公司产品;LXRα引物和GAPDH引物由上海英骏生物技术有限公司设计并合成;Taq DNA聚合酶、2000bp DNA Ladder、SYBE GREEN 1和DEPC处理水均为广州达晖生物技术有限公司产品;LXRα一抗为山羊抗大鼠多克隆抗体为美国Santa Cruz公司的产品;免疫组化染色SABC试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司的产品〔内含①5%BSA封闭液;②二抗工作液:亲和纯化抗体,标记长臂生物素(山羊抗大鼠IgG);③SABC:链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物;浓缩型DAB试剂是武汉博士德生物工程有限公司的产品;多聚赖氨酸是广州普博仪器有限公司的产品;乙醇、氯仿、异丙醇均为国产分析纯,及多聚甲醛、苏木素、伊红、二甲苯等常规试剂以及所用形态学玻片均购于暨南大学设备资源管理处。

  1.2 方法

  1.2.1 高脂肪乳剂的配制〔11〕

  配制方法:取玉米油400 g置于2 000 ml的烧杯里,放在磁力搅拌器上加热,待温度升到100℃时,加入100 g胆固醇溶化,充分搅匀,然后加入36.4 g(32 ml)吐温-80,制成油相。同时在另一烧杯中加入蒸馏水300 ml、蔗糖150 g、全脂奶粉80 g,食盐10 g和丙二醇31.1 g(3.2 ml),放在磁力搅拌器上加热至60℃,加入10 g脱氧胆酸钠,充分搅拌直至完全溶解,制成水相。然后将水相倒入油相中,充分混匀。待冷却至约40℃左右加入复合维生素2.5 g,复合微量元素1.5 g充分搅匀,即制成脂肪乳剂。

  1.2.2 实验动物造模及给药方法

  按照随机数字表将实验动物随机分为:正常组、模型组、疏肝组、健脾组、综合组。模型组15只,其余各组10只。正常组以基础饲料喂养,其余各组除基础饲料外,每天8:00AM灌饲高脂肪乳剂10 ml/kg 1次。所有动物自由进食饲料和饮清水,连续8 w。各药物干预组大鼠在施以造模因素的同时,按体重10 ml/kg给予相应药物,给药剂量按人和动物体表面积折算,其中疏肝组灌服柴胡疏肝散(含生药量0.32 g/ml),健脾组灌服参苓白术散(含生药量1.00 g/ml),综合组灌服柴胡疏肝散和参苓白术散的合方(含生药量1.19 g/ml),正常组和模型组灌服同样剂量的蒸馏水,每天下午1次。分别于饲养第6、8周,从模型组中随机抽取2只,3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,处死取肝脏进行病理检测,观察于第8周时可见中度脂肪变性,提示造模成功。

  1.3 指标检测

  各组动物于末次给药后,禁食不禁水12 h,所有大鼠以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉(0.1 ml/100 g),腹主动脉采血,取血后迅速摘取肝脏,距离肝边缘0.5 cm处取相同部位肝右叶组织,用于相关检测。

  1.3.1 肝组织病理染色

  距离肝边缘0.5 cm处取相同部位肝右叶约2 cm×2 cm×0.3 cm组织小块,以体积分数10%甲醛固定标本,常规石蜡包埋,作5 μm连续切片,HE染色。

  1.3.2 脂质及肝功检测

  腹主动脉采血,用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、TC、TG的含量。取肝组织0.1 g加入0.9 ml异丙醇中,匀浆,离心(4℃,3 000 r/min,10 min),提取上清液,用全自动生化分析仪检测肝组织匀浆中TC、TG的含量。

  1.3.3 RT-PCR方法检测肝组织LXRα mRNA

  ①肝脏总RNA的提取和逆转录反应:50mg肝组织液氮中研磨,利用RNA提取试剂盒提取总RNA,在波长260 nm处紫外检测RNA量,并计算浓度。采用Oligo(dT)逆转录法,依照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)说明书操作,将RNA通过逆转录反应合成cDNA。②引物设计:从Genebank中查找大鼠LXRα基因序列,以大鼠GAPDH作为内参照,用Primer5.0软件系统对引物进行设计和分析,由上海英骏生物技术有限公司合成,引物序列:LXRα上游 5'-ATTTCAGTTACAACCGGGAAGAC-3'下游 5'-ACCCAACCCTTTGACTCTCTTTA-3'扩增产物 540 bp;GAPDH上游 5'-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3' 下游 5'-ACCTGGTCCTCAGTGTAGCC-3'扩增产物 497 bp。③PCR扩增:采用50 μl体系进行,取0.2 ml PCR反应管,在冰盒上依次加入以下各试剂:5×RT-Buffer 10 μl,上游引物 0.5 μl,下游引物 0.5 μl,dNTP Mixture(各10 mM)0.5 μl,Taq酶1 μl,Rnase Free H2O 32.5 μl,模板cDNA 5 μl。反应条件:预变性93℃ 4 min,变性94℃ 30 s,退火54℃ 30 s,延伸72℃ 1 min,35个循环;延伸72℃ 10 min,4℃终止反应。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳,将各组PCR产物和上样缓冲液以5∶1比例上样,100 V、1 h电泳,显示DNA条带。应用Image-Master VDS图像扫描分析系统测定目的条带与内参条带的吸光度值,LXRαmRNA表达量用GAPDH内参进行标准化,结果用LXRα条带的光密度值/GAPDH条带的光密度值表示。

  1.3.4 免疫组织化学方法检测肝组织LXRα蛋白

  取距离肝边缘0.5 cm处相同部位肝左叶组织小块,大小约2 cm×2 cm×0.3 cm,经4%多聚甲醛溶液固定,常规脱水、石蜡包埋,作5 μm连续切片,免疫组化SABC法染色,DAB显色。采用SABC法检测LXRα蛋白表达水平。观察LXRα免疫组化染色部位,实验结果判断以细胞核或胞浆出现淡黄至深棕色颗粒,染色强度高于背景非特异性染色者为阳性表达。用PBS液替代一抗作为阴性对照,每个标本高倍镜下取20个不同视野,经暨南大学医学院中心实验室图像分析中心的Leica Qwin V3图象软件进行分析处理,体视学图像分析显示出各自的平均灰度值、着色面积区域百分比。

  1.4 统计学处理

  计量资料以x±s表示,多个样本均数比较用单因素方差分析,采用SPSS 13.0统计软件进行分析。

  2 结 果

  2.1 肝脏病理染色

  常规HE染色显示,对照组肝小叶结构规则,细胞索排列整齐,肝窦正常,肝细胞呈多边形,边界清,无明显病变,核圆结构清晰,位于细胞中央,胞浆丰富红染,细胞质均匀,肝细胞内无脂滴沉积。模型组大鼠肝小叶结构明显紊乱,肝细胞肿胀,胞质中出现大小不等的脂滴空泡,以大泡性脂肪滴为主,核居边,细胞界限不清。各药物干预组脂滴空泡有所减少,肝细胞脂肪变性较模型组有不同程度改善(图1)。图1 大鼠肝组织病理变化(HE,×200)

  2.2 脂质及肝功检测

  与正常组比较,模型组大鼠血清ALT、AST、TC、TG及肝组织中TC、TG含量明显升高(P<0.01、P<0.05);与模型组比较,疏肝组、健脾组及综合组AST水平明显降低(P<0.01),ALT水平均有一定程度下降,但差异无统计学意义(P>0.05),其中各药物干预组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05);各药物干预组大鼠血清TC、TG 含量均明显下降(P<0.01、P<0.05),其中,均以疏肝组最低,但各药物组组间比较无显著性差异(P>0.05);各用药组大鼠肝组织TC含量明显降低(P<0.05),其中,以疏肝组下降趋势更为明显,健脾组、疏肝组大鼠肝组织TG含量明显下降(P<0.05),综合组虽有一定的下降趋势但无统计学差异(P>0.05)。见表1,表2。

  2.3 肝组织LXRα mRNA的表达

  各组大鼠肝组织LXRα mRNA均有不同程度的表达,模型组表达最高,与正常组比较有显著性差异(P<0.01);与模型组比较,各药物干预组大鼠肝组织LXRα mRNA表达水平显著下降(P<0.01或P<0.05);各药物组组间比较,LXRα mRNA表达水平由低到高依次为:健脾组<疏肝组<综合组,但差异无统计学意义。见表3、图2。表1 各组大鼠血清ALT、AST、TC、  TG含量的比较

  2.4 肝组织LXRα蛋白的表达

  LXRα蛋白在各组动物中均有表达,正常组大鼠肝组织内仅有少量棕黄色颗粒散在分布;模型组肝组织内棕黄色颗粒明显增多,以肝窦周围及汇管区明显;各药物干预组肝组织内棕黄色颗粒较模型组不同程度减少且表达强度降低。图像分析结果统计显示:与正常组比较,模型组大鼠肝组织LXRα蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,各药物干预组大鼠肝组织LXRα蛋白表达均有明显下降(P<0.01);各药物组组间比较,疏肝组与健脾组肝组织LXRα蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),但两者与综合组比较均明显降低(P<0.05)。提示高脂肪乳剂可诱导大鼠肝组织LXRα蛋白表达升高;疏肝健脾方药能下调NAFLD大鼠肝组织LXRα蛋白表达水平,以健脾组表达最低,健脾方可能发挥了更为明显的作用。见表3,图3。表2 各组大鼠肝组织TC、TG含量的比较表3 各组大鼠肝组织LXRα mRNA及蛋白的表达1:正常组;2:模型组;3:疏肝组;4:健脾组;5:综合组图2 各组大鼠肝组织LXRα mRNA的表达图3 各组大鼠肝组织LXRα蛋白免疫组化图片(DAB,×200)

  3 讨 论

  NAFLD 的典型特征是肝脏脂肪积聚,各种原因引起肝脏内脂质代谢自稳的破坏致使脂质在肝内异常沉积,是肝脂肪变性的共同机制,也是NAFLD发病机制中最基础、最关键的环节之一〔12〕。肝X受体(LXRs)是孤核受体家族的成员,因在肝脏表达丰富而命名。LXRs分为LXRα及LXRβ两种亚型,均能被内源性配体氧化固醇或人工合成配体激活后,与类视黄醇X受体(RXR)结合形成异二聚体,LXRs/RXR异二聚体通过与靶基因中称为LXR反应元件(LXRE)的特定核苷酸序列结合而调节该基因的转录,从而影响机体的生理活动〔3〕。近年来研究发现LXRα在肝脏中表达最为丰富,可以感知肝细胞内氧化甾醇的含量,是调控肝脏脂质代谢的重要核转录因子,也是目前为国内外学者所关注的脂代谢通路的关键信号转导因子,与NAFLD密切相关〔13〕。另有研究发现,LXRα在脂肪的生成、氧化、分泌、脂质过氧化及炎症因子的生成等多环节发挥作用,并且在同一环节中,由于其结合于不同的靶基因上,可能表现为相反的结果。LXRα是一把双刃剑,一方面,通过上调固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(FAS)、碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)等基因的表达,促进脂肪酸的从头合成及抑制脂酸的β氧化,从而使TG在肝细胞内蓄积和增加ROS产生,导致NAFLD的形成与进展〔14〕;另一方面,通过上调脂蛋白脂肪酶(LPL)、磷脂转移蛋白(PLTP)、胆固醇-7α羟基(CYP7A1)等基因的表达和拮抗NF-κB炎症信号通路,促进脂肪酸的β氧化、VLDL合成与分泌和抑制炎症因子的生成,防止NAFLD的发生和发展〔15〕。LXRα究竟在对NAFLD起着保护作用,还是作为恶化因素推动疾病的进展尚未明确。本实验研究结果说明高脂乳剂可能在蛋白和基因两个水平上调肝脏LXRα的表达,这与相关研究结果相一致〔16〕。进一步提示了LXRα可能在促进NAFLD的发生发展中具有重要的作用和意义。

  中医学认为,脂质属于精微物质的范畴,为人体新陈代谢所必需,这种精微物质来源于饮食水谷,而饮食物的消化吸收、水谷精微的输布代谢,有赖于脾之运化功能与肝之疏泄功能,二者相互协调、相互为用维持动态平衡,即脂质代谢自稳态。研究发现〔6〕,从初期到中期的NAFLD患者多为肝郁脾虚证,以疏肝、健脾法作为基本治法,运用经典方柴胡疏肝散及参苓白术散加减治疗NAFLD收到了较好的效果。本实验证明疏肝健脾方药能调节NAFLD大鼠脂质代谢,降低大鼠血清及肝组织 TC、TG的含量,改善肝脏病理受损;目前,肝功能检查主要是指反映肝细胞损伤项目的血清酶学检测,药物组血清ALT、AST降低,提示疏肝健脾方能够改善大鼠NAFLD肝郁、脾虚症状,对肝细胞膜、线粒体膜有保护、修复和稳定作用,能够促进NAFLD大鼠肝细胞的恢复。与模型组比较,各药物组LXRα mRNA及蛋白表达均有显著降低,其中以健脾组最为显著,表明疏肝健脾方药可能是通过下调LXRα mRNA及蛋白的表达水平而改善NAFLD大鼠肝脏脂质代谢异常状态,发挥了较好的防治NAFLD的作用。提示肝郁脾虚在 NAFLD发生发展过程中可能具有重要的作用,LXRα可能是疏肝健脾方药发挥作用的重要靶点之一,其详细机制尚需进一步探讨。

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  (编辑 曹梦园)

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