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多发性骨髓瘤成骨细胞活性和Runx2的表达

首席医学网      2012年07月22日 13:57:27 Sunday  
 
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作者:郑晓强 陈君敏    作者单位:(福建医科大学附属第一医院血液科,福建 福州 350000)

【摘要】  目的 研究多发性骨髓瘤(MM)患者间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞(OB)分化过程中Runx2的表达,探讨MM骨形成障碍的机制。方法 以4例有明显骨质破坏的MM患者为研究对象,2例缺铁性贫血和1例特发性血小板减少性紫癜为对照,体外诱导MSCs向OB分化,采用CCK-8试剂盒检测MSCs向OB分化过程中的增殖能力,以平均光密度值(AOD)表示;碱性磷酸酶(ALP)染色和钙结节(Von-Kossa)染色检测MSCs的OB形成能力,分别以IOD sum/Area sum值和平均钙结节个数表示;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测MSCs向OB分化过程中Runx2的表达,以Runx2/GAPDH平均光密度值表示。结果 在MSCs向OB分化过程中,MM患者MSCs的增殖能力、ALP表达、钙结节形成能力、Runx2表达均明显低于对照组(P<0.01)。结论 MM患者骨髓MSCs向OB分化过程中的增殖能力和OB形成能力均下降,可能与Runx2的表达减低有关。

【关键词】  多发性骨髓瘤;间充质干细胞;成骨细胞

  【Abstract】 Objective To evaluate Runx2 expression of mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow of multiple myeloma (MM),and discuss the mechanism of osteoblast inhibition in MM.Methods Bone marrow was collected from four MM patients with obvious osteolytic lesion.The control group included two patients with iron deficiency anemia and one with idiopathic thrombocytopenic purpura.MSCs were induced to differentiate into OB in vitro.CCK-8 kit was employed to analyze MSCs proliferation,defined as the average optical density(AOD).Alkaline phosphatase staining and Von-Kossa staining were performed to assess osteoblast formation,defined as IOD sum/Area sum and the average of calcium nodules respectively.RT-PCR assays were applied to detect Runx2 expression of MSCs,defined as Runx2/GAPDH average optical density.Results There was significant difference in the proliferation of MSCs between MM and control group. The osteoblast formation was less in MM group than that of control group.RT-PCR assays showed that Runx2 expression was significantly lower in MM than that in control group (all P<0.01).Conclusions In the course of differentiation of MSCs into OB,bone marrow MSCs from MM patients are characterized with a low proliferation and osteoblast formation,which may be associated with lower expression of Runx2.

  【Key words】 Multiple myeloma;Mesenchymal stem cells;Osteoblasts

  骨髓瘤骨病(MBD)是由于破骨细胞(OC)活性增强及成骨细胞(OB)活性受抑制的结果〔1〕,是多发性骨髓瘤(MM)的特征性病变。近年来,MM患者中存在OB发育障碍受到广泛关注,其机制还不清楚,Runx2是调控OB发育的关键因子〔2〕,其是否参与MM骨形成障碍的机制,国内尚未见有报道。本文对MM患者间充质干细胞(MSCs)向OB分化过程中的生物特性和Runx2的表达进行研究。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  L-DMEM培养基干粉、PBS粉剂、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司),人淋巴细胞分离液(上海试剂二厂,比重1.077±0.001),新生胎牛血清、青链霉素(Hyclone公司),地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C(美国Sigma公司),BCIP /NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(碧云天生物技术研究所),引物合成(上海生工),Trizol液(Tri Reagent公司),cDNA第一链合成试剂盒(Fermentas公司),聚合酶链反应试剂、标记物、焦碳酸二乙酯、PCR Master Mix、琼脂糖(厦门泰京生物工程有限公司)。

  1.2 骨髓间充质干细胞的分离和培养

  MM组骨髓标本取自4例MM患者,经骨髓细胞学、病理学、影像学和血液生化检查,符合MM诊断标准〔3〕,全身多处骨质破坏,国际分期系统(ISS)均为Ⅲ期。其中男3例,女1例,平均年龄(64.3±4.92)岁,4例均为IgG型,其中К轻链型3例,λ轻链型1例。对照组骨髓标本为2例缺铁性贫血,1例特发性血小板减少性紫癜。平均年龄(58.8±5.63)岁。抽取骨髓液5 ml,加入肝素管中,颠倒混匀防止凝固。加入等体积PBS,混匀,1 000 r/min离心5 min,去除脂肪及上清。加入等体积PBS,吹打混匀。将细胞悬液加至盛有等体积淋巴细胞分离液的离心管中,2 500 r/min离心30 min。收集中间层面云雾状单个核细胞层,L-DMEM培养液(为含10%新生胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/L链霉素的低糖DMEM)洗涤细胞,1 000 r/min离心5 min。调整细胞密度为106/ml,接种于25 cm2培养瓶,放入37℃,5%CO2培养箱。培养5 d后首次换液,以后每3天换液,每日倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。当细胞汇合到90%时(约2 w),用0.25%胰蛋白酶消化,按1∶2比例传代。

  1.3 MSCs的增殖能力

  MSCs培养至3代,2 ml 0.25%胰蛋白酶溶液37℃消化,制成单细胞悬液。用含地塞米松(10-8 mol/L)、维生素C(0.05 g/L)和β-甘油磷酸钠(10-2mol/L)的L-DMEM条件培养液调节细胞浓度至45 000/ml,吸取调整好的细胞悬液100 μl至0.32 cm2的96孔板,设3个复孔,上下平行对照,连续接种7板,按照CCK-8试剂盒说明书每隔24小时测量1板,连续测量7 d。吸净孔板中培养液,增设1孔未接种细胞的孔调零,每孔加入100 μl无血清培养基和10 μl CCK-8溶液,置于37℃,5% CO2培养箱孵育2 h,在酶标仪450 nm处读取OD值,打印数据。

  1.4 MSCs的OB形成能力

  将培养至第3代MSCs采用含地塞米松(10-8 mol/L)、维生素C(0.05 g/L)和β-甘油磷酸钠(10-2mol/L)的L-DMEM条件培养液重新悬浮,接种105个细胞至放有载玻片的6孔板,放入37℃,5%CO2培养箱培养,每3天半量换液。分别在第14天和第28天取出盖玻片(即细胞爬片)进行ALP和Von Kossa染色。显微镜底下每个标本选取10个100倍视野,用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件计算IOD sum/Area sum值,比较MM组和对照组ALP的表达。光镜下人工随机计数钙结节个数,比较MM组和对照组钙结节形成能力。

  1.5 MSCs Runx2的表达

  1.5.1 对照组MSCs样品准备

  取对照组第3代的MSCs,接种106个细胞至6孔板,每3天完全培养液换液,待细胞约80%融合后,吸净完全培养液,加入条件培养液进行诱导,分别在诱导的第0、24、48、72小时收集细胞。

  1.5.2 MM组MSCs样品准备

  取MM组和对照组第3代的MSCs,接种106个细胞至6孔板,每3天完全培养液换液,待细胞80%融合后,吸净完全培养液,加入条件培养液,72 h后收集细胞。收集1×106个细胞置于一EP管,细胞总RNA提取及逆转录按试剂盒说明书进行操作。放置PCR仪进行扩增,引物序列如下:Runx2引物:上游:5′- TGCTGGAGTGATGTGGTTTTCT -3′,下游:5′- CCCCTGTTGTGTTGTTTGGTAA -3′,扩增片段长度为276 bp。内参GAPDH引物:上游:5′-ACCACAGTCCATGCCATCA -3′,下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,扩增片段长度450 bp。扩增条件:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃退火50 s,72℃延伸1 min,35个循环后72℃延长10 min。取10 PCR产物,1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,电压为110 V,电流与电压相对应,时间为40 min,缓冲液为0.5×TAE,指示剂为溴酚兰,凝胶成像自动分析仪下照相,并计算Runx2/GAPDH的平均光密度值。

  1.6 统计学处理

  数据均以x±s表示,采用SPSS13.0软件分析数据,数据呈正态分布采用t检验或方差分析,非正态分布采用非秩和参数检验。

  2 结 果

  2.1 MM患者骨髓MSCs的增殖能力

  CCK-8试剂盒检测MSCs增殖能力的数据显示,在条件培养液诱导下,MM组和对照组MSCs在第3~4天均进入对数生长期,第5天增殖速度下降,细胞增殖进入平台期。诱导7 d,MM组MSCs增殖能力低于对照组,平均光密度(AOD)值分别为1.195±0.631和1.493±0.890(t=2.163,P<0.05)。

  2.2 MM患者骨髓MSCs向OB的分化能力

  MM组ALP表达和平均钙结节个数均明显低于对照组,IOD sum/Area sum值分别为0.204±0.050和0.339±0.034(t=12.132,P<0.01),平均钙结节个数分别为16.7±5.61和11.1±6.14(Z=-3.494,P<0.01)。

  2.3 MM患者骨髓MSCs Runx2的表达

  MSCs未被诱导时可弱表达Runx2,72 h后呈强表达,Runx2/GAPDH平均光密度值分别为0.637±0.074和0.973±0.086(P<0.01)。且MM组Runx2的表达明显低于对照组,Runx2/GAPDH平均光密度值分别为0.412±0.199和0.734±0.149(t=5.761,P<0.01)。

  3 讨 论

  MM骨病是由于MM骨髓微环境中的骨髓瘤细胞产生OC刺激因子,如TNF-α、RANKL、MIP-1α、SDF-1α、IL-1β、IL-6、IL-3等刺激OC的增殖与分化,而增殖成熟的OC通过直接或间接的作用促进骨髓瘤细胞的增殖并使其免于凋亡,从而形成一个恶性循环,导致MM骨病的发生〔1,4〕。缓解期的MM患者尽管骨髓中无骨髓瘤细胞且OC活性完全被抑制,但其溶骨性病变并未见好转〔5〕,骨髓瘤细胞和OC的恶性循环学说不能解释这一点。骨髓MSCs的OB分化障碍亦参与了MM骨病的发生。胡晓丽等〔6〕对7例MM骨髓MSCs的OB形成能力研究表明,MM患者MSCs的OB形成能力显著降低。本文结果说明,MM患者具有MSCs一般的生物学特性,但是增殖能力和OB形成能力降低。因此,目前认为,OC活性增强和OB发育障碍共同参与了MM骨病的发生〔7~12〕。

  关于OB发育障碍的机制,目前还不清楚,近年来的研究认为,OB特异性转录因子Runx2参与其中。Runx2是OB分化的特异性标志,它属于转录因子RUNX 家族,可限制性地表达于骨组织中。Runx2-/-小鼠由于OB分化障碍而表现为膜内骨及软骨内钙化的完全缺失〔13〕。Runx2在MSCs向OB分化过程中起着决定性作用,在分化早期,决定着MSCs向成骨系细胞分化,分化为OB后,Runx2使OB保持在未成熟阶段,抑制其向成熟骨细胞的转变〔2〕。本结果显示,MSCs未被诱导时便弱表达Runx2,这可能与MSCs具有潜在分化OB的功能有关,因此我们推测,MSCs传至3代后,便有潜在分化OB的可能。ALP和钙结节形成是OB成熟的标志,呈强阳性表达分别需要诱导14 d和28 d,而Runx2在MSCs诱导24、48 h后表达逐渐增强,72 h后呈强表达,这说明,Runx2在前成骨细胞期便呈强表达。对MM组和对照组MSCs向OB分化过程中Runx2的表达进行比较,结果显示MM组Runx2的表达明显低于对照组。这一结果与Giuliani的研究是一致的,他们用免疫组化方法对40例MM患者的骨组织进行检测发现,MM骨髓微环境中Runx2表达明显低于正常人〔7〕。以上结果表明,Runx2主要作用于MSCs向成骨系细胞分化的早期,MM患者MSCs OB形成能力能力下降可能与其Runx2的表达减少有关。

【参考文献】
    1 Barille-Nion S,Bataille R.New insights in myeloma-induced osteolysis〔J〕.Leuk Lymphoma,2003;44:1463-7.

  2 Komori T.Regulation of osteoblast differentiation by transcription factors〔J〕.J Cell Biochem,2006;99(5):1233-9.

  3 Kyle RA,Rajkumar SV.Multiple myeloma〔J〕.N Engl J Med,2004;351:1860-73.

  4 Yaccoby S,Wezeman MJ,Henderson A,et al.Cancer and the microenvironment:myeloma-osteoclast interactions as a model〔J〕.Cancer Res,2004;64:2016-23.

  5 Epstein J,Walker R.Myeloma and bone disease:“the dangerous tango”〔J〕.Clin Adv Hematol Oncol,2006;4(4):300-6.

  6 胡晓丽,冯 磊,傅晋翔,等.骨髓瘤细胞抑制骨髓问充质干细胞向成骨细胞的转化〔J〕.中国组织工程研究与临床,2007;11(46):9221-5.

  7 Giuliani N,Colla S,Morandi F,et al.Myeloma cells block RUNX2/CBFA1 activity in human bone marrow osteoblast progenitors and inhibit osteoblast formation and differentiation〔J〕.Blood,2005;106(7):2472-83.

  8 Ehrlich LA,Chung HY,Ghobrial I,et al.IL-3 is a potential inhibitor of osteoblast differentiation in multiple myeloma〔J〕.Blood,2005;106(4):1407-14.

  9 Oshima T,Abe M,Asano J,et al.Myeloma cells suppress bone formation by secreting a soluble Wnt inhibitor,sFRP-2〔J〕.Blood,2005;106(9):3160-5.

  10 Weitzmann MN,Roggia C,Toraldo G,et al.Increased production of IL-7 uncouples bone formation from bone resorption during estrogen deficiency〔J〕.J Clin Invest,2002;110(11):1643-50.

  11 Wang FS,Ko JY,Lin CL,et al.Knocking down dickkopf-1 alleviates estrogen deficiency induction of bone loss.A histomorphological study in ovariectomized rats〔J〕.Bone,2007;40(2):485-92.

  12 Tian E,Zhan F,Walker R,et al.The role of the Wnt-signaling antagonist DKK1 in the development of osteolytic lesions in multiple myeloma〔J〕.N Engl J Med,2003;349(26):2483-94.

  13 Kato M,Patel MS,Levasseur R,et al.Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation,osteopenia,and persistent embryonic eye vascularizationin mice deficient in Lrp5,a Wnt coreceptor〔J〕.J Cell Biol,2002;157:303-14.

  (编辑 曹梦园)

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