您所在位置: 首页 > 期刊 > 过刊浏览 > 内科学> 《中国老年学杂志》> 2012年11月31卷22期>文章> 文章详情

吉林地区深静脉血栓患者JAK2V617F突变

首席医学网      2012年07月22日 13:47:40 Sunday  
 
  加入收藏夹   官方投稿信息

作者:张 阳 董丙非1 李 红 赵文光 王宏飞1    作者单位:吉林大学第一医院肝胆外科 (吉林大学第一医院血管外科,吉林 长春 130021)

【摘要】  目的 探讨吉林地区深静脉血栓患者JAK2V617F突变情况。方法 应用等位基因特异性PCR检测50例深静脉血栓患者外周血基因组DNA中是否存在JAK2V617F突变。结果 50例深静脉血栓患者中均未检出JAK2V617F突变。结论 JAK2V617F突变在吉林地区深静脉血栓患者中不存在或发生率很低,可能不是引起吉林地区深静脉血栓疾病的原因。

【关键词】  深静脉血栓;JAK2V617F;突变

  2005年,多个研究小组同时发现了骨髓增殖性疾病(MPDs)患者JAK2基因存在获得性点突变,即JAK2假激酶调节结构域JH2第617位的缬氨酸(V)残基被苯丙氨酸(F)残基取代(JAK2V617F)〔1~5〕。此结构域在正常情况下起到抑制JAK2激酶活性的作用,发生突变后抑制作用减弱,使JAK2激酶活性增强。近来多项研究表明JAK2V617F突变与静脉血栓疾病密切相关〔6~8〕,而对于不伴有MPDs的深静脉血栓患者的JAK2V617F突变情况国内尚无报道。本研究采用等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,ASP)方法检测JAK2V617F的突变情况,研究该突变在吉林地区深静脉血栓患者中的发生情况。

  1 材料与方法

  1.1 病例筛选

  所选50例深静脉血栓患者由吉林大学第一医院血管外科提供。入选标准:①不伴有内脏静脉血栓;②依据临床症状、体征和辅助检查可排除MPDs。其中男23例,女27例;年龄20~82岁,平均60岁。病后就诊时间3 h~3个月。

  1.2 基因组DNA提取

  采集外周抗凝血(EDTA)1 ml,利用全血基因组DNA提取试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司)提取基因组DNA。

  1.3 应用ASP方法检测JAK2V617F突变

  1.3.1 等位基因特异性引物的设计

  根据相关文献〔9〕报道的JAK2V617F引物设计方法,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。引物序列见图1,P1r和P2r为JAK2外显子14基因片段5′端引物,P1和P2为JAK2外显子14基因片段3′端引物,Pnf为无突变位点的特异性引物,Pm为含有突变位点的特异性引物。Pl:GATCTCCATATTCCAGGCTTACACA Plr:TATTGTTTGGGCATTGTAACCTTCT;P2:CCTCAGAACGTTGATGGCA;P2r:ATTGCTTTCCTTTTTCACAAGA;Pnf:AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATG Pmr:GTTTTACTTACTCTCGTCTCCACAAAA图1 PCR引物

  1.3.2 ASP检测

  1.3.2.1 首轮PCR反应

  使用P1及P1r引物,以基因组DNA为模板,扩增带有JAK2激酶突变位点的JAK2基因14号外显子片段,产物大小为521 bp。PCR反应在20 μl的PCR反应体系中进行:10 ×PCR缓冲液2 μl,dNTP(10 mmol/L 每种)0.4 μl,5′端引物P1和3′端引物P1r各0.2 μl,模板DNA 1 μl,H2O 16 μl,Taq DNA 聚合酶0.2 μl。PCR反应条件:94℃ 1 min;94℃ 15 s,61℃ 30 s,72℃ 30 s(28个循环);72℃ 5 min。

  1.3.2.2 巢式PCR反应

  使用P2、P2r、Pnf及Pmr两对引物,以首轮PCR的反应产物为模板,扩增带有JAK2V617F突变位点的基因片段,其中含有点突变的特异性产物大小为278 bp,无点突变的特异性产物大小为230 bp。PCR反应在20 μl的PCR反应体系中进行:10 ×PCR缓冲液2 μl,dNTP(10 mmol/L 每种)0.4 μl,5′端引物P2、Pnf和3′端引物P2r、Pmr各0.2 μl,第一轮PCR产物0.5 μl,H2O 16.1 μl,Taq DNA 聚合酶0.2 μl。PCR反应条件:94℃ 1 min;94℃ 15 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s(30个循环);72℃ 5 min。3%琼脂糖凝胶电泳后,观察结果。

  2 结 果

  在50例患者中均未发现JAK2V617F突变。

  3 讨 论

  JAK2激酶是一个涉及细胞生长的信号转导通路中的酪氨酸激酶。在2005年,一些研究小组陆续在真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、原发性骨髓纤维化(IMF)等疾病中鉴定出了一种JAK2获得性点突变,即JAK2的假激酶调节结构域JH2的第617位的缬氨酸(V)残基被苯丙氨酸(F)残基取代(JAK2V617F)。这一发现使MPDs发病机制的研究取得了突破性的进展。2008年,JAK2V617F转基因小鼠研制成功〔10〕。这种转基因小鼠出现了类似人类MPDs的症状,并且随着JAK2V617F基因拷贝数的增加,MPDs的症状也随之严重,这为JAK2V617F能够引起MPDs提供了明确的证据。

  MPDs患者具有较高的血栓形成、栓塞的危险率,而最近研究表明在31%~59%的非MPDs的内脏静脉血栓患者中检测到JAK2V617F突变,对存在JAK2V617F突变的非MPDs的内脏静脉血栓患者的随访研究表明部分患者已发展成为MPDs,推测JAK2V617F突变与非MPDs的静脉血栓患者的血栓形成、栓塞密切相关,可能成为潜在的MPDs患者的标志物〔11~13〕。

  本研究在50例深静脉血栓患者中未检测到JAK2V617F突变,与国外报道深静脉血栓患者JAK2V617F的低突变率或无突变的结果一致〔14,15〕。可见在吉林地区深静脉血栓患者中JAK2V617F突变不存在或发生率很低,可能不是引起吉林地区深静脉血栓疾病的原因。对比内脏静脉血栓患者中JAK2V617F相对较高的突变率,深静脉血栓患者中JAK2V617F低突变率或无突变是否预示着血栓形成或栓塞存在组织特异性尚待进一步研究。同时,本研究收集的病例有限,还有待于收集大量标本进一步加以证实,为深静脉血栓患者中潜在的MPDs基因诊断提供实验证据。

【参考文献】
    1 Baxter E,Scott L,Campbell P,et al.Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders〔J〕.Lancet,2005;365(9464):1054-61.

  2 James C,Ugo V,Le Couédic J,et al.A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera〔J〕.Nature,2005;434(7037):1144-8.

  3 Kralovics R,Passamonti F,Buser A,et al.A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders〔J〕.N Engl J Med,2005;352(17):1779-90.

  4 Levine R,Wadleigh M,Cools J,et al.Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera,essential thrombocythemia,and myeloid metaplasia with myelofibrosis〔J〕.Cancer Cell,2005;7(4):387-97.

  5 Goerttler P,Steimle C,Mrz E,et al.The Jak2V617F mutation,PRV-1 overexpression,and EEC formation define a similar cohort of MPD patients〔J〕.Blood,2005;106(8):2862-4.

  6 Patel RK,Lea NC,Heneghan MA,et al .Prevalence of the activating JAK2 tyrosine kinase mutation V617F in the Budd-Chiari syndrome〔J〕. Gastroenterology,2006;130(7):2031-8.

  7 Xavier SG,Gadelha T,Pimenta G,et al.JAK2V617F mutation in patients with splanchnic vein thrombosis〔J〕.Dig Dis Sci,2010;55(6):1770-7.

  8 Dentali F,Squizzato A,Brivio L,et al .JAK2V617F mutation for the early diagnosis of Ph- myeloproliferative neoplasms in patients with venous thromboembolism:a meta-analysis〔J〕.Blood,2009;113(22):5617-23.

  9 Xu X,Zhang Q,Luo J,et al.JAK2(V617F):Prevalence in a large Chinese hospital population〔J〕.Blood,2007;109(1):339-42.

  10 Xing S, Wanting TH, Zhao W, et al. Transgenic expression of JAK2V617F causes myeloproliferative disorders in mice〔J〕.Blood,2008;111(10):5109-17.

  11 Kiladjian J,Cervantes F,Leebeek F,et al.The impact of JAK2 and MPL mutations on diagnosis and prognosis of splanchnic vein thrombosis:a report on 241 cases〔J〕.Blood,2008;111(10):4922-9.

  12 Colaizzo D,Amitrano L,Tiscia G,et al.Occurrence of the JAK2 V617F mutation in the Budd-Chiari syndrome〔J〕.Blood Coagul Fibrinolysis,2008;19(5):459-62.

  13 Austin S,Lambert J.The JAK2 V617F mutation and thrombosis〔J〕.Br J Haematol,2008;143(3):307-20.

  14 Ugo V,Le Gal G,Lecucq L,et al.Prevalence of the JAK2 V617F mutation is low among unselected patients with a first episode of unprovoked venous thromboembolism〔J〕.J Thromb Haemost,2008;6:203-5.

  15 Za T,Fiorini A,Rossi E,et al.Prevalence of the JAK2 V617F mutation in patients with unprovoked venous thromboembolism of common sites and without overt myeloproliferative neoplasms〔J〕.Br J Haematol,2009;144:965-7.

  (编辑 徐 杰)

  订阅登记:

请您在下面输入常用的Email地址、职业以便我们定期通过邮箱发送给您最新的相关医学信息,感谢您浏览首席医学网!

邮箱:    专业:    职称:      

医学期刊医学会议医学专区医学护理