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胃癌患者外周血微转移指标的检测及意义

首席医学网      2012年07月22日 13:34:22 Sunday  
 
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作者:费建东 聂双发 胡晓峰 梁 峰 郭 飞 安永铸    作者单位:(河北北方学院附属第一医院普外科,河北 张家口 075000)

【摘要】  目的 研究癌胚抗原(CEA)、肝素酶(Hpa)、多巴脱羧酶(DDC)、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、磷酸丝氨酸磷脂酶(PSPH)与胃癌早期转移之间的关系。方法 利用RT-PCR检测方法对80例胃癌患者及16例胃良性病变患者及20例健康体检者的血清进行检测,检测胃癌患者外周血中CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA的表达。结果 胃癌组较胃良性瘤组及健康组外周血CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA表达阳性率明显增高(P<0.05);在胃癌组中,五种标志物阳性率中CEA mRNA最高,差异有统计学意义(P<0.05);胃癌组CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA这五种指标在肿瘤部位、临床分期、组织学类型、pTNM、淋巴结转移及肝转移间阳性率比较均有统计学差异(P<0.05);随着临床分期的增加,这些肿瘤标志物的表达率也明显升高。结论 胃癌患者外周血中存在CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA表达,CEA mRNA阳性率最高,该五项指标能预测外周血微转移和判断预后。

【关键词】  胃癌;外周血微转移;RT-PCR;CEA mRNA;Hpa mRNA;DDC mRNA;MMP-7 mRNA;PSPH mRNA

  导致胃癌治疗失败及死亡的根本原因是肿瘤的复发和转移,而复发和转移的基础是肿瘤的微转移,即在治疗之前患者血液中存在目前技术条件检测不到的微转移。因此,预防复发和转移的有效措施就是及早的检测和治疗存在的微转移。在肿瘤细胞未形成影像学可观察到的转移结节前,血内就存在一些与肿瘤有关的标记物,其中角蛋白家族(CK)及癌胚抗原(CEA)是目前研究较多的胃癌微转移肿瘤标记物,但由于实验条件及检测手段的不同导致检测结果不一〔1~3〕。本研究选取与胃癌微转移密切相关的五种分子生物学标记物:CEA、肝素酶(Hpa)、多巴脱羧酶(DDC)、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、磷酸丝氨酸磷脂酶(PSPH)作为研究对象,探讨该五种肿瘤标记物能否作为判断胃癌外周血微转移的指标。

  1 资料与方法

  1.1 临床资料

  我院2007年1月至2010年1月收治的均经胃镜检查及活检证实的80例胃癌患者,男44例,女36例,年龄35~72〔平均(54.3±18.7)〕岁。肿瘤部位:贲门11例,胃底16例,胃体20例,胃窦部33例;组织学类型:腺癌42例,黏液腺癌15例,低分化腺癌14例,印戒细胞癌9例;pTNM分期:Ⅰ期11例,Ⅱ期26例,Ⅲ期34例,Ⅳ期9例;淋巴转移22例,肝转移3例。本组患者术前均未行放化疗及其他抗肿瘤治疗。以胃癌细胞株SGC-7901作阳性对照。胃肠道良性肿瘤16例,男9例,女7例,年龄33~71〔平均(54.1±17.2)〕岁,其中胃溃疡47例,胃平滑肌瘤23例,胃腺肌瘤5例,胃神经纤维瘤5例。既往均无恶性肿瘤病史。健康体检者20例,男11例,女9例,年龄28~57〔平均(42.3±13.5)〕岁。本研究所有患者均自愿加入并签署知情同意书。

  1.2 方法

  1.2.1 标本采集及单个核细胞的提取

  用含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的密封试管采集清晨空腹静脉血5 ml,混匀,在4℃的冰箱中静止一段时间,采用密度梯度离心法,用淋巴细胞分离液提取单个核细胞。细胞计数约106~107/ml。然后再用Trizol提取液提取总RNA。

  1.2.2 RT-PCR

  将各反应管快速离心混匀,置PCR仪中,设置反应条件:42℃孵育60 min,以mRNA为模板反转录合成第一条cDNA链,再99℃预变性5 min,灭活反转录酶(AMV),同时使杂交的RNA/cDNA变性,合成第二条cDNA链,然后进行PCR扩增各个标记物的cDNA引物序列,并用肌动蛋白(β-actin)作内对照。PCR产物6 μl上样于2%琼脂糖凝胶(0.5 μg/ml溴乙啶),电泳。

  1.2.3 检测PCR产物

  紫外成像仪成像并检测阳性者CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA和β-actin光密度值,计算相对系数。相对系数=目的基因/β-actin光密度值。对阳性产物进行测序分析。

  1.3 统计学分析

  应用SPSS13.0统计软件,计量资料正态分布以x±s表示,率的比较采用χ2检验,相对系数的比较采用t检验。

  2 结 果

  2.1 CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA在胃癌患者外周血中的表达

  胃癌组分别与胃良性瘤组及健康组患者比较,外周血CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA表达阳性率明显增高(P<0.05);在胃癌组中,五种标志物阳性率中CEA mRNA最高(P<0.05)。见表1。

  2.2 胃癌患者外周血中CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA表达与胃癌病理特征及临床分期的关系

  CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA这五种指标在肿瘤部位、临床分期、组织学类型、pTNM、淋巴结转移及肝转移间阳性率比较均有统计学差异(P<0.05)。随着临床分期的增加,这些肿瘤标志物的表达率也明显升高,有淋巴结及远处转移的患者较未转移的患者阳性率也明显升高。见表2。表1 CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA在胃癌患者外周血中的表达表2 胃癌患者外周血中CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA表达与胃癌病理特征及临床分期的关系

  3 讨 论

  恶性肿瘤微转移是指恶性肿瘤在发展过程中,肿瘤细胞从原发灶脱落,经发育不完善的基底膜或不完整的新生血管进入外周血循环,少数未被机体免疫系统清除的恶性程度较高的细胞形成癌细胞团,随血液循环到达其他组织器官形成转移灶〔4〕。因此,癌细胞进入血液循环是发生远处转移的先决条件。早期发现外周血微转移可筛选出有复发倾向的高危患者,对指导治疗及判断预后有重要意义。对外周血中恶性肿瘤标志物的检测是目前确定微转移的主要方法〔5〕,但由于外周血中这些标志物水平较低,往往常规检查方法检测不到,导致漏诊。RT-PCR可以通过对目的基因扩增从而检测出含量很少的检测物,是目前用于检测肿瘤微转移的常用分子生物学方法〔6〕。

  与胃癌有关的外周血微转移分子生物学标志物较多,目前研究对象主要集中于以下几类:(1)肿瘤细胞相关抗原,如CEA,CK蛋白家族;(2)细胞外基质成分及其降解酶,如Ⅳ型胶原、MMPs等;(3)黏附分子和细胞因子,如转化生长因子(TGF)、整合素等。上述分子生物学标记物都在外周血中进行过各种实验方法的检测,但由于所用试验方法、仪器试剂及所选样本数量与分期等条件的不同,各个研究结果并不一致,也无法并行比较哪种分子生物学标志物有更好的灵敏性和特异性,能够切实有效地提高脱落细胞的检出率,各方面也无法达成共识〔7~9〕。本研究表明CEA mRNA对胃癌外周血微转移有较好的诊断意义。本研究进一步细分,通过不同肿瘤部位、组织类型、临床分析、淋巴转移以及远处肝转移情况下标志物阳性率的分析发现,五种指标在肿瘤部位、临床分期、组织学类型、淋巴结转移及肝转移间阳性率比较,均有统计学差异(P<0.05);并且发现随着临床分期的增加,这些肿瘤标志物的表达率也明显升高,有淋巴结及远处转移的患者较未转移的患者阳性率也明显升高。

  综上,外周血中CEA mRNA、Hpa mRNA、DDC mRNA、MMP-7 mRNA、PSPH mRNA可作为判断胃癌微转移及预后评估的指标,其中CEA mRNA的阳性率最高,可作为胃癌早期诊断的常规筛查指标。上述五种指标能为胃癌的早期诊断、指导治疗提供理论依据,对减少胃癌的复发和转移具有及其重要的临床意义。

【参考文献】
    1 Zieglschmid V,Hollmann C,Bocher O.Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood〔J〕.Crit Rev Clin Lab Sci,2005;42(2):155-96.

  2 陈 杰,李甘地.病理学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2005:7.

  3 Illert B,Fein M,Otto C,et al.Disseminated tumor cells in the blood of patients with gastric cancer are an independent predictive marker of poor prognosis〔J〕.Scand J Gastroenterol,2005;40(7):843-9.

  4 Zhang XW,Yang HY,Fan P,et al.Detection of micrometastasis in peripheral blood by multi-sampling in patients with colorectal cancer〔J〕.World J Gastroenterol,2005;11(3):436-8.

  5 Demirbas S,Sücüllü I,Yildirim S,et al.Influence of the c-erbB-2,nm23,bcl-2 and p53 protein markers on colorectal cancer〔J〕.Turk J Gastroenterol,2006;17(1):13-9.

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  7 Vlems FA,Diepstra JH,Cornelissen IM,et al.Limitations of cytokeratin 20 RT-PCR to detect disseminated tumour cells in blood and bone marrow of patients with colorectal cancer:expression in controls and downregulation in tumour tissue〔J〕.Mol Pathol,2002;55(3):156-63.

  8 王贵英,李 勇,王士杰.胃癌患者外周血及骨髓微转移检测的临床意义〔J〕.中国肿瘤临床,2004;31(7):405-7.

  9 邢全台,袁孟彪,孙启龙,等.检测胃癌患者外周血微转移端粒酶hTERT-mRNA的意义〔J〕.肿瘤,2003;23(4):321-3.

  (编辑 袁左鸣/徐 杰)

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