您所在位置: 首页 > 期刊 > 过刊浏览 > 内科学> 《中国老年学杂志》> 2012年11月31卷22期>文章> 文章详情

粪便标本基因标记物mRNA检测在老年癌性肠梗阻诊断中的价值

首席医学网      2012年07月22日 13:30:28 Sunday  
 
  加入收藏夹   官方投稿信息

作者:曹春远 马 震 董 强 王钟林 赵金伟    作者单位:(吉林省人民医院,吉林 长春 130021)

【摘要】  目的 通过多基因mRNA表达检测癌性肠梗阻病人粪便,观察三种标记物定性检测诊断癌性肠梗阻的价值。方法 27例通过X线或腹部CT证实为肠梗阻的病人,同时手术证实20例为癌性肠梗阻,7例为非癌性肠梗阻,20例癌性肠梗阻病人中有14例伴发肝转移,采用RT-PCR技术检测粪便基因标记物mRNA表达。结果 联合检测粪便COX-2、CK-20、CD44v6 mRNA对癌性肠梗阻的诊断率为90%(18/20),敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及准确性分别为94.7%,85.7%,90%,85.7%及88.9%。结论 联合检测粪便COX-2,CK-20,CD44v6 mRNA表达可作为无法行镜检的癌性肠梗阻病人的无创性诊断手段。

【关键词】  粪便;mRNA;RT-PCR;癌性肠梗阻

  近年来,随着生活水平的提高及饮食结构的改变,结直肠癌高龄病人逐渐增多,且同时伴发的疾病增多,有创性的结直肠镜检依从性越来越差,粪便基因检测的前景越来越广阔。目前,粪便基因mRNA标记物的研究刚刚起步,日本学者对粪便COX-2 mRNA检测分析发现,COX-2 mRNA表达对结肠癌诊断具有较高的敏感性和特异性〔1〕,但采用多种基因联合检测用于无法行结肠镜检查的癌性肠梗阻病人的诊断尚未见文献报道。本研究旨在验证粪便基因检测在无法行结肠镜检查的癌性肠梗阻病人诊断中的应用。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  收集吉林省人民医院及吉林省肿瘤医院2009年3月至2010年5月经X线和/或腹部CT确诊的27例结肠梗阻病例,均经手术治疗,术中及术后确定诊断。20例为结直肠癌所致肠梗阻,男13例,女7例,年龄63~85岁,中位年龄67.3岁;7例为非癌性肠梗阻,男3例,女4例,年龄61~81岁,中位年龄68岁。20例癌性肠梗阻中有14例伴发肝脏转移。手术前清水灌肠收集粪便标本放置于-80℃冰箱冰冻保存,备用。

  1.2 粪便标本的预处理

  粪便标本解冻后,取成形粪便标本3~5 d或水样便100 ml加入100 ml液基细胞保存液搅拌均匀后,依次经过100目筛网、200目筛网,1 200 r/min离心10 min后弃去上清液,加提取液重悬沉淀至50 ml,过300目筛网,1 200 r/min离心10 min后弃去上清液,取沉淀加入液基细胞保存液1.5 ml置于1.5 ml Eppendorf管中,上述标本处理1 h完成,并置于-80℃冰箱中保存。

  1.3 PT-PCR法检测粪便及外周血标本中COX-2、CK-20、CD44v6 mRNA表达

  1.3.1 总RNA提取

  用DEPC严格处理实验器材以防止RNA酶污染。 解冻组织标本或粪便预处理后的标本,研磨后加入PBS洗涤,1 000 r/min,5 min,弃上清 →加1 ml Trizol,室温放置5 min,转到EP管,加0.2 ml氯仿重悬沉淀,剧烈振摇,室温静置5 min →4℃ 12 000 r/min,离心15 min→上层水相移至另一个EP管(宁少勿多)→加入0.5 ml冰异丙醇→充分混匀,室温放置10 min→4℃12 000 r/min,离心15 min,去上清→加入75%冰乙醇-DEPC 1 ml,振摇洗涤沉淀→4℃ 12 000 r/min,离心10 min,弃上清→去乙醇,空气中干燥RNA→加DEPC水(10~50 μl),溶解RNA→所得的总RNA置于-80℃冰箱保存。

  1.3.2 RNA纯度及完整性检测

  取RNA样品用紫外-可见光分光光度计于260 nm、280 nm处测定A值,计算RNA浓度和RNA定量。取RNA样品进行甲醛变性,1%琼脂糖凝胶电泳,拍照,用光密度扫描仪扫描28 s和18 s条带,计算密度比值。

  1.3.3 引物设计〔2~4

  〕 实验所需引物及内参照β-actin引物均系上海生工生物工程公司合成,经GenBank检索为特异性引物。DNA Marker采用宝生物工程有限公司DL2000 Marker。

  1.3.4 RT-PCR检测

  (1)逆转录:RNA 4 μl+Oligo dT 2 μl+DEPC 10 μl→72℃,5 min,变性模板RNA→迅速放置冰上,复性模板RNA→5×buffer 5 μl+10 mmol/L dNTP 2 μl+25 U/μl Rnasin 1 μl+200 U/μl mmlv 1 μl→42℃,1 h→94℃,5 min→冰上,5 min,置-80℃储存。(2)聚合酶链式反应:反应体系包括灭菌去离子水32 μl;10×PCR buffer 5 μl,10 mmol/L dNTP 1 μl,10 pmol上游引物1 μl;10 pmol下游引物1 μl,cDNA(0.1 μg/μl)1 μl。(3)Taq DNA聚合酶(2 U/μl)0.2 μl扩增条件:β-actin:取cDNA 2 μl,加入10 × Buffer 2 μl,25 mmol/L氯化镁溶液1.2 μl,Taq酶1 U,22.5 mmol/L dNTPs 0.16 μl,β-actin引物0.1 μg,加去离子水至20 μl进行PCP扩增。每次设一管不加样品cDNA为阴性对照。反应条件为94℃预变性5 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30个循环,72℃延长7 min。基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶(含0.1%溴化乙啶)电泳,拍照。

  目的基因:逆转录产物2 μl,加入10 × PCR Buffer 3 μl,目的基因引物20 pmol,β-actin引物4 pmol,Taq DNA酶1 U, DEPC处理过的水至30μl。反应条件为95℃预变性2 min,95℃变性1 min,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,共45个循环。基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶(含0.1%溴化乙啶)电泳,拍照。

  1.3.5 结果判定

  图片中出现305 bp、370 bp、125 bp的条带分别为COX-2 、CK-20及CD44v6 mRNA表达阳性。

  1.4 统计学分析

  应用统计软件SPSS10.0进行χ2检验。

  2 结 果

  2.1 粪便标本基因标记物mRNA表达与癌性肠梗阻的相关性

  90%(18/20)的癌性肠梗阻病人粪便标本中至少有一种基因 mRNA表达阳性,7例非癌性肠梗阻中有14.2%(1/7)病人有至少一种基因mRNA表达阳性,二者差异显著(P=0.000 2)。

  2.2 联合检测粪便基因标记物mRNA表达对癌性肠梗阻的诊断价值

  联合检测的敏感性(Se)、特异性(Sp)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)及准确性(Ac)分别为94.7%,85.7%,90%,85.7%及88.9%。

  3 讨 论

  本结果提示采用RT-PCR技术对结直肠癌粪便标本COX-2、CK-20及CD44v6 mRNA表达进行检测可以用于无法行结肠镜检查的癌性肠梗阻病人的定性诊断。采用RT-PCT技术对肠梗阻病人的粪便标本进行检测可以诊断肠梗阻的性质,同时也可对肿瘤生物靶向治疗靶点的选择提供理论依据。

【参考文献】
    1 Shigeru S,Yoshida K,Miura N,et al.Potential usefulness of detection cyclooxygenase 2 messenger RNA in feles for colorectal cancer screening〔J〕.Gastroenterology,2004;127(2):422-7.

  2 Wai K,Leung K,Ellen PS,et al.Detection of hypermethylated DNA or cyclooxygenase-2 messenger RNA in fecal samples of patients with colorectal cancer or polyps〔J〕.Am J Gastroenteral,2007;102:1070-6.

  3 卢培琳,季 峰,彭克荣,等.胃癌患者CD44mRNA 的表达〔J〕.浙江医学,2004;26(3):184-6.

  4 Stephen A,Bustin T,Shabab S,et al.Quantification of cytokeratin 20,carcinoembryonic antigen and guanylyl cyclase C Mrna levels in lymph nodes may not predict treatment failure in colorectal cancer patients〔J〕.Int J Cancer,2004;108:412-7.

  (编辑 徐 杰)

  订阅登记:

请您在下面输入常用的Email地址、职业以便我们定期通过邮箱发送给您最新的相关医学信息,感谢您浏览首席医学网!

邮箱:    专业:    职称:      

医学期刊医学会议医学专区医学护理