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缺血后处理对高血脂大鼠缺血/再灌注心肌Caspase-3活性的影响

首席医学网      2012年05月07日 14:21:12 Monday  
 
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作者:安 莉,霍玉娥,刘胜辉    作者单位:河北大学附属医院心内科, 河北 保定市  071000

【摘要】  目的:观察缺血后处理对高血脂大鼠缺血再灌注心肌Caspase(半胱氨酸天冬氨酸酶)-3活性的影响。方法:选择高血脂SD大鼠48只,随机分为3组:假手术组(开胸后穿线做套环,但不收紧结扎线)、缺血再灌注组(收紧结扎线缺血40 min, 放松结扎线再灌注240 min)、缺血后处理组(缺血40 min后, 再灌注10 s,缺血10 s,连续3个循环,然后再灌注240 min),每组16只。再灌注结束后自右颈动脉采血,测定血清肌酸激酶(CK)活性,再灌注心肌凋亡程度,及Caspase-3活性,并进行比较分析。结果:再灌注结束后,①缺血后处理组和缺血再灌注组CK活性明显高于假手术组 [(745.26±62.18)U/L比(926.38±76.49)U/L比(237.67±21.82)U/L], 缺血后处理组明显低于缺血再灌注组(P均<0.05);②心肌凋亡细胞计数:假手术组未见明显细胞凋亡(<5%),缺血后处理组心肌细胞凋亡率明显低于缺血再灌注组 [(11.7±2.6)%比(20.8±3.4)%,P<0.05];③缺血后处理组缺血区心肌组织 Caspase-3活性明显低于缺血再灌注组[(545.79±98.25)μmol PNA/mg比(739.83±113.57)μmol PNA/mg,P<0.01]。结论: 缺血后处理可以减轻高血脂大鼠缺血再灌注损伤,其心肌保护作用可能与降低Caspase-3活性有关。

【关键词】  高脂血症;再灌注损伤;心肌;细胞凋亡

  Abstract:Objective: To study influence of ischemic postconditioning on Caspase(cysteine aspartase)-3 activity in myocardium of rats with hyperlipidemia after ischemia/reperfusion (I/R). Methods:A total of 48 SD rats with hyperlipidemia were randomly divided into sham operation group (n=16), I/R group (n=16, ligated to cause ischemia for 40 min, then reperfused for 240 min) and ischemic postconditioning group (n=16, after 40 min ischemia, reperfused for 10s and ischemia for 10s for three cycles, then reperfused for 240 min). After reperfusion, blood sample was taken from right carotid artery to measure activity of creatine kinase (CK), Caspase-3 activity and apoptotic extent of myocardial cells. These indicators were compared and analyzed among three groups. Results:After reperfusion, ① CK activity in ischemic postconditioning group and I/R group were significantly higher than that of sham operation group [(745.26±62.18) U/L vs. (926.38±76.49) U/L vs. (237.67±21.82) U/L], and that of ischemic postconditioning group was significantly lower than that of I/R group (P<0.05 all); ② There was no obvious apoptosis (<5%) in sham operation group, apoptosis rate of myocardial cells in ischemic postconditioning group was significantly lower than that of I/R group [(11.7±2.6)% vs. (20.8±3.4)%, P<0.05]; ③ Caspase-3 activity in ischemic myocardial tissues in ischemic postconditioning group was significantly lower than that of I/R group [(545.79±98.25) μmol PNA/mg vs. (739.83±113.57) μmol PNA/mg, P<0.01]. Conclusion: Ischemic postconditioning can relieve ischemia/reperfusion injury in rats with hyperlipidemia; its myocardial protection may be related with decrease of Caspase-3.

  Key words: Hyperlipidemia; Reperfusion injury; Myocardium; Apoptosis

  缺血后处理是指心肌发生缺血后,开始再灌注时进行数次短暂再灌注/缺血循环的处理方式,它是近年提出的一种新的减轻再灌注损伤的方法,研究表明缺血后处理可以缩小心肌梗死面积,减少再灌注心律失常,具有心肌保护作用[1-4]。本研究旨在探讨在体情况下缺血后处理对高血脂大鼠缺血/再灌注心肌Caspase(半胱氨酸天冬氨酸酶)-3活性的影响。

  1 资料与方法

  1.1 动物模型制备及分组

  1.1.1 动物模型制备:高血脂SD大鼠48只,以30 g/L戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉, 仰卧固定于鼠台,行气管切开,用呼吸机进行机械通气,通气频率60次/min, 潮气量20~30 ml/kg,取左胸第3肋间进胸,暴露心脏,于左心耳根部下方1 mm处进针, 5-0 丝线(结扎线) 穿过心肌表层在肺动脉圆锥处稍下方穿线,线两端各穿一小缝合垫片后再并线一起经内径约2 mm的聚乙烯管中穿出,用血管钳推压小管压迫左冠状动脉前降支造成缺血,放松即可恢复血流形成再灌注,收紧结扎线心电图出现ST段抬高, 放松结扎线ST段下降1/2 以上为模型成功。

  1.1.2 动物分组:随机分为3组:①假手术组,开胸后对冠脉穿线做套环,但不收紧结扎线;②缺血再灌注组,收紧冠脉结扎线缺血40 min, 放松结扎线再灌注240 min;③缺血后处理组,缺血40 min后, 再灌注10 s,缺血10 s,连续3个循环,然后再灌注240 min。

  1.2 检测指标

  1.2.1 肌酸激酶(CK)的检测:再灌注结束后自右颈动脉分别采血2 ml, 3000 r/min离心10 min。采用7180型全自动生化分析仪(日本日立公司)检测CK 的含量,参照试剂盒(北京中山生物技术有限公司)说明书操作。

  1.2.2 凋亡细胞原位标记与凋亡指数计算:再灌注结束后,将缺血区心肌组织剪下,以40 g/L多聚甲醛固定24 h,常规石蜡包埋,用TUNEL技术标记凋亡的细胞核,在免疫荧光显微镜下观察心肌细胞凋亡情况,每个标本选取5张切片,每张切片选取5个视野(×400),统计细胞总数和凋亡细胞数,以平均阳性细胞数所占的百分比作为凋亡指数。

  1.2.3 Caspase-3活性检测:采用Caspase-3活性检测试剂盒 (Chemicon International Molecular, Temecula, USA) 检测。操作步骤参照试剂盒说明。

  1.3 统计学分析

  采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理,计量数据以均数±标准差(x-±s)表示,两组间比较采用t检验,三组间采用方差分析,P<0.05为差异有显著性。

  2 结 果

  2.1 血清中CK活性的测定

  再灌注结束后缺血后处理组和缺血再灌注组CK活性明显高于假手术组[(745.26±62.18)U/L比(926.38±76.49)U/L比(237.67±21.82)U/L,P<0.05], 缺血后处理组明显低于缺血再灌注组(P<0.05)。

  2.2 心肌凋亡细胞计数

  再灌注结束后假手术组未见明显细胞凋亡(<5%),缺血后处理组心肌细胞凋亡率明显低于缺血再灌注组[(11.7±2.6)%比(20.8±3.4)%,P<0.05]。

  2.3 心肌Caspase-3 活性

  再灌注结束后假手术组心肌Caspase-3 活性[(238.16±64.92)μmol PNA/mg],显著低于缺血后处理组,缺血区心肌组织 Caspase-3活性又明显低于缺血/再灌注组[(545.79±98.25)μmol PNA/mg比(739.83±113.57)μmol PNA/mg,P均<0.01]。

  3 讨 论

  缺血后处理对缺血再灌注心肌的保护作用是2003年赵志清教授首先发现的,他在犬的在体缺血再灌注模型中,给予再灌注30 s,缺血30 s,连续3个循环,结果发现缺血后处理可以缩小心肌梗死面积,具有心脏保护作用[1],随后缺血后处理的心肌保护作用在多种动物得到证实。2005年,Staat等[3]率先在临床上证实了缺血后处理的心肌保护作用,其后又有临床研究表明缺血后处理能够减轻急性心肌梗死患者急诊经皮冠状动脉介入(PCI)后的再灌注损伤[5,6]。

  细胞凋亡主要通过两条基本途径——死亡受体和线粒体途径完成的[7]。这两条通路的诱因以及起始部分不同,但殊途同归,最终都引起Caspase-3的激活。Caspase-3可使Caspase活化DNA酶(CAD)激活而使DNA裂解、裂解细胞骨架蛋白[8]、降解多聚ADP核糖聚合酶(PRAP),PRAP是DNA修复酶,在DNA损伤时被激活,一旦裂解后就失去DNA修复活性,并可使核酸内切酶活性增加,使细胞易于发生凋亡[9],抑制Caspase活性可以减少心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的发生[10-14]。

  本研究结果表明,缺血后处理可以减轻高血脂大鼠缺血再灌注损伤,其心肌保护作用可能与降低Caspase-3活性有关。

【参考文献】
    [1]Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2):H579-H588.

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  [3]Staat P,Rioufol G,Piot C,et al. Postconditioning the human heart[J].Circulation,2005,112(14):2143-2148.

  [4]刘胜辉,霍玉娥,尹博美.缺血后处理对大鼠缺血/再灌注心肌髓过氧化物酶及细胞间粘附分子的影响[J].心血管康复医学杂志,2009,18(2):107-109.

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  [6]Ma X, Zhang X, Li C, et al. Effect of postconditioning on coronary blood flow velocity and endothelial function and LV recovery after myocardial infaction[J].J Interv Cardiol,2006,19(5):367-375.

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