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蛹虫草(北冬虫夏草)提取物对高糖诱导的内皮细胞衰老和细胞内活性氧的影响

首席医学网      2012年05月07日 14:07:53 Monday  
 
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作者:    作者单位:福建医科大学省立临床医学院,福建省立医院干部特诊科,福建省临床老年病研究所,福建 福州 350001

【摘要】  目的:探讨蛹虫草乙酸乙酯提取物(GSCME)对高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的衰老和细胞内活性氧的影响。方法:体外培养HUVECs,分3组:对照组(D-葡萄糖5.5 mmol/L)、高糖组(D-葡萄糖40 mmol/L)、GSCME组(GSCME 50μg/ml+D-葡萄糖40 mmol/L),检测各组细胞增殖情况,SA-β-gal阳性衰老细胞,周期分布和细胞内活性氧(ROS)含量。结果:与对照组相比,高糖干预24、48、72h后细胞增殖活性显著下降[OD: 48h:(0.599±0.062)比(0.375±0.013)],P均<0.01;高糖孵育48h后SA-β-gal阳性细胞率[(50.70±1.49)%比(89.63±0.69)%]、G0/G1期细胞百分率 [ (49.15±2.56)%比(76.59±3.58)%]、细胞内活性氧(ROS)水平[(1.03±0.15)比(3.60±0.36)]均明显增加,P均<0.01。与高糖组相比,GSCME孵育48 h、72 h HUVECs增殖率显著上升[48h: (0.375±0.013)比(0.424±0.023)],P均<0.05,孵育48h显著降低SA-β-gal阳性细胞率 [(89.63±0.69)%比(65.81±1.50)%]、 G0/G1期细胞百分率[(76.59±3.58)%比(52.70±5.64)%]及细胞内ROS水平[(3.60±0.36)比(1.67±0.21) ],P<0.05~0.01。结论:蛹虫草提取物可延缓高糖诱导的人脐静脉内皮细胞衰老进程,降低细胞内活性氧从而减轻细胞氧化损伤可能是其作用的机制之一。

【关键词】  内皮细胞;细胞衰老;抗氧化剂

  Abstract:Objective: To study influence of ethyl acetate extract of Cordyceps militaris (GSCME) on senescence of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and reactive oxygen species (ROS) in cells induced by high glucose. Methods:HUVECs were cultured in vitro and divided into control group (cultured with D-glucose 5.5 mmol/L), high glucose group (cultured with D-glucose 40 mmol/L) and GSCME group (cultured with GSCME 50 μg/ml+D-glucose 40 mmol/L). HUVECs proliferation, SA-β-gal positive senescence cell, distribution of cell cycles and concentrations of ROS in cells were measured in each group. Results:Compared with control group, after incubated with high glucose for 24, 48 and 72h, proliferation activity of HUVECs significantly decreased [OD: 48h: (0.599±0.062) vs. (0.375±0.013)], P<0.05 all]; after incubated with high glucose for 48h, there were significant increase in SA-β-gal positive cell rate [(50.70±1.49)% vs. (89.63±0.69)%], percentage of G0/G1 period cells [ (49.15±2.56)% vs. (76.59±3.58)%]and level of ROS [(1.03±0.15) vs. (3.60±0.36)], P<0.01 all. Compared with high glucose group, HUVECs proliferation rate significantly increased after incubated with GSCME for 48h and 72h [48h: (0.375±0.013) vs. (0.424±0.023),]P<0.05 both; after incubation with CME for 48h, there were significant decrease in SA-β-gal positive cell rate [(89.63±0.69)% vs. (65.81±1.50)%], percentage of G0/G1 period cells [(76.59±3.58)% vs. (52.70±5.64)%]and ROS level in cells [(3.60±0.36) vs. (1.67±0.21) ]in GSCME group, P<0.05~<0.01. Conclusion: GSCME can delay senescence progression of HUVECs induced by high glucose. One of its possible mechanisms may be ROS level in cell decrease, so it decreases oxidative damage of cells.

  Key words: Endothelial cells; Cell aging; Antioxidants

  研究表明,内皮细胞衰老参与年龄相关的内皮功能失常和动脉粥样硬化等心血管疾病的发生与发展[1]。细胞衰老表现为细胞增殖活性减低、体现衰老特性的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性升高、细胞周期停滞于G0/G1期[2]。目前认为多种机制参与了内皮细胞衰老,其中比较公认的是氧化应激学说[3]。高糖可提高内皮细胞内活性氧(ROS)水平,使细胞处于氧化应激状态,促使内皮细胞发生衰老[4-5]。

  蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草或北虫草,与冬虫夏草(Cordyceps sinensis)属同属异种。新近研究认为蛹虫草中含有虫草素、虫草酸、虫草多糖等多种功能活性物质,具有抗氧化、抗衰老等多种生物活性[6]。本研究观察蛹虫草乙酸乙酯提取物(GSCME)对高糖诱导体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老和细胞内ROS的影响。

  1 资料与方法

  1.1 材料与试剂

  蛹虫草乙酸乙酯提取物(福建师范大学生命科学学院提供);M199培养基干粉、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco公司,美国);Ⅰ型胶原酶、TRIZOL试剂(Invitrogen公司,美国);兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组化多克隆抗体及相关二抗(福州迈新公司,中国);内皮细胞生长添加剂(ECGS)、D-葡萄糖、二甲亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)(Sigma公司,美国);细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒、活性氧检测试剂盒(碧云天公司,中国)。

  1.2 方法

  1.2.1 HUVECs的原代培养与鉴定:用Ⅰ型胶原酶灌注消化法分离新鲜脐带静脉的内皮细胞,于含100μg/ml ECGS,20% FBS,100U/ml青、链霉素,2 mmol/L谷氨酰胺,100U/ml肝素钠的M199混合培养液中培养。倒置显微镜下观察见生长至融合的内皮细胞呈典型的铺路石形状,且Ⅷ因子相关抗原免疫组化法鉴定95%以上细胞为阳性时可用于进一步实验。实验采用第3~5代细胞。

  1.2.2 GSCME的配制:GSCME用DMSO溶解,配成浓度为0.1g/ml的溶液,临用前用M199培养液稀释为相应的作用浓度,并使培养液中DMSO的终浓度小于0.1%。

  1.2.3 MTT法检测细胞增殖:将5×104/ml HUVECs接种于96孔平底板中,每孔加入200μl铺板,同步化后根据以下实验分组干预细胞:对照组(D-葡萄糖5.5 mmol/L)、高糖组(D-葡萄糖40 mmol/L)、GSCME组(GSCME 50 μg/ml+D-葡萄糖40 mmol/L),作用48 h后,每孔加入20μl MTT溶液,继续培养4h。小心吸去孔内培养液,每孔加入150μl DMSO,低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶标仪光密度值(OD)490nm处测量各孔的OD值。

  1.2.4 SA-β-半乳糖酐酶(SA-β-gal)染色:SA-β-gal阳性衰老细胞的鉴定依据参考文献[7]。干预完成后,吸除细胞培养液,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次后,用4%多聚甲醛和0.2%戊二醛4℃固定15min。吸净固定液,PBS洗涤细胞3次,每次3min,吸净PBS,在新鲜配置的X-Gal染液中,37℃孵育过夜。普通光镜下计数胞浆蓝染细胞数目,每种细胞计数4个视野,每个视野至少100个细胞。

  1.2.5 流式细胞术检测细胞周期分布:处理完成后,消化、收集1×106细胞,1000 r/min离心5min,PBS洗2次,-20℃预冷的75%乙醇4℃固定过夜。离心弃去乙醇,细胞用冷PBS洗3次,加入终浓度为50 μg/ml的PI染液和终浓度为1 mg/ml的RNA酶A,37℃避光反应30min,300目网筛过滤细胞。流式细胞仪分析细胞周期,激发光波长488 nm,发射光波长570 nm,细胞流速不超过60 cells/min,至少选取10000个细胞,用BD公司提供的Moldifit 2.0分析数据。

  1.2.6 流式细胞术细胞内活性氧检测:细胞干预完成后胰酶消化,使细胞浓度为2×105/ml。按照1∶1000用无血清培养液稀释2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA),使终浓度为10μmol/L。细胞收集后悬浮于DCFH-DA中,37℃孵育20min,用无血清培养液洗涤细胞3次,流式细胞仪检测至少10000个细胞的平均荧光强度。

  1.3 统计学方法

  采用SPSS 18.0分析软件,计量数据采用均数±标准差(x-±s)表示。组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P <0.05为差异有显著性。

  2 结 果

  2.1 GSCME对高糖诱导的HUVECs衰老的抑制作用

  在作用24、48、72h后,高糖组OD值均明显低于对照组(P<0.01)。经GSCME孵育48 h、72 h后,GSCME组OD值均明显高于高糖组(P均<0.05),见表1。表1 GSCME对高糖诱导HUVECs增殖抑制的保护作用

  2.2 GSCME对高糖作用下HUVECs β-半乳糖苷酶活性的影响

  孵育48h后,高糖组SA-β-gal染色阳性率明显高于对照组(P<0.01);经GSCME孵育后,细胞SA-β-gal阳性细胞率较高糖组明显降低(P <0.01),见表 2。 表2 GSCME对高糖作用下脐静脉内皮细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率的影响

  2.3 GSCME对高糖作用下HUVECs细胞周期分布的影响

  孵育48h后,高糖组的细胞G0/G1期百分率明显高于对照组(P <0.01),GSCME组的细胞G0/G1期百分率较高糖组显著降低(P <0.05),见表3。表3 GSCME对高糖作用下HUVECs细胞周期分布的影响

  2.4 GSCME对高糖作用下细胞内ROS水平的影响

  孵育48h后,高糖组细胞内ROS水平较对照组明显升高(P <0.01);经GSCME孵育后ROS水平较高糖组明显降低(P <0.01),见表4。表4 GSCME对高糖作用下细胞内活性氧水平的影响

  3 讨 论

  糖尿病是一种常见的代谢性疾病,全球目前约有2.4亿糖尿病患者。与非糖尿病人相比,糖尿病人群患动脉粥样硬化等心血管病的风险高2.5~4.0倍,寿命缩短可达10年[8]。高龄也是心血管病的独立危险因素,故老年糖尿病患者更易发生心血管病[9]。大量文献报道,内皮细胞的损伤和功能异常是高龄、糖尿病等高危因素引起动脉粥样硬化等心脑血管疾患的始动环节[10-11]。

  细胞衰老是细胞增殖能力逐渐减弱的现象,目前认为人体细胞的衰老,尤其是内皮细胞的衰老,与人体的器官衰老之间存在着密切的关系 [12]。有研究表明,高糖可通过不同机制引起内皮细胞的衰老[13],而内皮细胞的衰老参与了内皮功能失调和动脉粥样硬化等心血管病的发生和发展[1],因此本研究也采用高糖诱导建立内皮细胞衰老的模型,应用GSCME进行抗衰老研究。

  业已证实,细胞衰老伴随着β-半乳糖苷酶活性、细胞增殖能力以及细胞周期的改变。本研究结果发现,高糖诱导内皮细胞β-半乳糖苷酶活性升高,胞浆蓝染阳性细胞率增加,细胞增殖能力减弱,细胞周期停滞于G0/G1期,诱导人脐静脉内皮细胞衰老模型的成功建立。经GSCME干预后,发现细胞增殖活力明显增强,β-半乳糖苷酶活性降低,G0/G1期细胞比例下降,提示GSCME具有保护细胞衰老作用。

  根据氧化应激学说,细胞内ROS增加可直接造成内皮细胞的损伤,如损伤生物膜,引起膜通透性和硬度增加,改变细胞内环境稳定性,引起细胞内DNA及蛋白质的损伤,干扰信号传导通路并且能抑制端粒酶的活性,从而加速细胞衰老[14]。有研究表明蛹虫草具有强大的抗氧化作用[6,15]。本研究也发现GSCME能抑制高糖诱导的内皮细胞ROS增加。因此,GSCME提取物可能通过降低内皮细胞内ROS水平,抑制氧化应激诱导的内皮细胞损伤,从而抑制内皮细胞衰老。

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