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    使用大环糖肽抗生素键合固定相高效液相色谱法直接拆分卡巴拉汀

    首席医学网      2007年07月20日 07:57:28 Friday  
     

    作者:许哲 周宁 许旭* 许杏祥    作者单位:中国科学院上海有机化学研究所,上海 200032;中国科学院研究生院,北京 100039

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    【摘要】  采用高效液相色谱法在大环糖肽抗生素键合固定相手性柱上拆分了卡巴拉汀(Rivastigmine) 对映体。考察了甲醇∶乙酸∶三乙胺流动相体系中乙酸和三乙胺的浓度和比例、有机酸的种类、分离温度及流动相流速对拆分结果的影响。选定的色谱条件为:Chirobiotic V 手性柱 (250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm),流动相为V(甲醇)∶V(乙酸)∶V(三乙胺)=100∶0.02∶0.01,柱温5℃,流速0.5 mL/min,检测波长274 nm。在柱温5~30℃范围内测定lnα与1/T呈线性关系:lnα=ΔΔH0/RT+ΔΔR0/R。

    【关键词】  高效液相色谱法,对映体拆分,手性固定相,卡巴拉汀

      1  引言

      阿尔茨海默症(alzheimer′s disease,AD)即早老性痴呆,是一种原发性中枢神经系统的退行性变性疾病。目前临床研究中的抗AD药物主要是乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEI)[1]。卡巴拉汀(rivastigmine),即(-)S 氮乙基3[(1二甲氨基)乙基]氮甲氨基甲酸苯酯,是一种选择性作用于大脑的乙酰胆碱酯酶抑制剂,用于治疗中轻度AD [2]。药理研究表明,卡巴拉汀的S(-)构型降低乙酰胆碱酯酶活性的能力是R(+)构型的10倍[3]。Pommier 等[4]发展了重现性好的 LCMSMS方法,用于定量分析人血浆中的卡巴拉汀及其代谢产物;Albert等[5]将反相液相色谱与ESI联用,可同时分析大鼠血浆和组织匀浆中的卡巴拉汀及其代谢产物。Mallikarjuna 等[6]利用反相 HPLC 定量测定了药物中的卡巴拉汀酒石酸盐含量。卡巴拉汀对映体拆分的报道较少。有文献报道采用以环糊精及其衍生物为手性添加剂的毛细管电泳方法,实现了卡巴拉汀的对映拆分[3,7]。Srinivasu等[8]在Chiralcel OJH 柱上以正相模式拆分了卡巴拉汀酒石酸盐对映体。本研究利用商品化手性液相色谱柱直接拆分了卡巴拉汀对映异构体。考察了流动相酸碱添加剂的种类、浓度、比例、温度、流速等因素对样品保留参数和对映体拆分能力的影响,实现了样品的手性分离。

      2  实验部分

      2.1  仪器与试剂Waters 484 紫外检测器,Waters 510型高效液相色谱泵,Rheodyne 7125液相色谱进样阀,HCT360色谱柱恒温箱(上海泉岛)。数据采集和处理采用HS2000普及版色谱工作站(英谱科技,杭州)。甲醇(MeOH,HPLC级,Tedia 公司),乙腈(ACN,HPLC级,Tedia公司),其它均为国产分析纯。卡巴拉汀盐酸盐的消旋体及S构型光活样品由上海有机所三维药物研究中心提供。

      2.2  色谱条件Chirobiotic V 手性柱(250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm),购自ASTEC公司(美国);检测波长274 nm;流动相为甲醇乙酸三乙胺体系,恒温箱温度为5℃;除注明外,流速均为1.0 mL/min。

      2.3  样品溶液的配制样品用甲醇配成浓度为1.0 g/L的溶液,经0.45 μm 微孔膜过滤直接进样,进样量为5 μL。对映体流出顺序通过对S构型光活样品进样来确定。

      3  结果与讨论

      3.1  手性柱的选择为了找到一种合适的LC 方法分离卡巴拉汀盐酸盐对映体,实验中筛选了Chirobiotic V (250 mm×4.6 mm i.d.,ASTEC,美国),Cyclobond  I  2000 RN (250 mm × 4.6 mm i.d.,ASTEC,美国),CHIDEXSKP (250 mm × 4.6 mm i.d.,CST,新加坡),Chiralpak ADRH (250 mm × 4.6 mm i.d.,Daicel,日本),Chiralpak ASRH (250 mm × 4.6 mm i.d.,Daicel,日本),Chiralpak IA (250 mm × 4.6 mm i.d.,Daicel,日本),Cyclobond I 2000 (250 mm × 4.6 mm i.d.,ASTEC,美国),Cyclobond I 2000 SN (250 mm × 4.6 mm i.d.,ASTEC,美国)8根手性色谱柱并使用不同的流动相。经初步筛选观察到,在所尝试的8根商品化手性柱中,卡巴拉汀能够被其中Chirobiotic V柱手性分离(典型分离谱图见图1)。 

      图1  卡巴拉汀对映体在Chirobiotic V 柱上的拆分谱图(略)

      Fig.1  Enantioseparation of rivastigmine on Chirobiotic V column

      卡巴拉汀的洗脱顺序由相应的S卡巴拉汀确定(elution order of rivastigmine is conformed by corresponding Srivastigmine);流动相(mobile phase):甲醇/乙酸/三乙胺(CH3OH/acetic acid/triethylamine)=100∶0.02∶0.01 (V/V);流速(flow rate):0.5 mL/min;柱温(temperature):5℃。
       
      3.2  在大环抗生素Chirobiotic V柱上的对映拆分Armstrong等[9]首先将大环抗生素用作手性固定相,并发展了一系列商品化的手性色谱柱。Chirobiotic V手性柱的固定相万古霉素 (Vancomycin)作为一种“协同型”手性固定相,其手性拆分的机理目前尚未完全明了[10]。

      3.2.1  流动相中乙酸和三乙胺浓度及比例的影响  以未添加乙酸/三乙胺的纯甲醇作流动相,手性样品很难从柱上洗脱(>90 min)。分别固定乙酸和三乙胺的浓度,简单考察了两者比例(1∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1)对分离的影响(图2)。比较表明,酸碱比例为2∶1时,卡巴拉汀对映体的分离效果最好。而当三乙胺的含量大于乙酸时,卡巴拉汀在90 min内不能从色谱柱上洗脱出来。 

      图2  乙酸/三乙胺比例对卡巴拉汀对映体分离的影响(略)

      Fig.2  Influence of acetic acid/triethylamine (TEA) ratio on the enantioseparation of rivastigmine

      流速(flow rate):1.0 mL /min;其它条件同图1(other conditions are the same as in Fig.1)。保持乙酸与三乙胺比例为2,改变流动相中酸/碱的加入量,酸碱的含量对分离效果的影响见表1。酸碱总浓度减少,卡巴拉汀的保留增加,但分离因子α的变化不大。当酸/碱浓度为002%/0.01%(V/V)时,卡巴拉汀可在较短的时间内以较好的分离度(RS=1.410)得到分离。

      表1  酸碱浓度对卡巴拉汀对映体分离的影响(略)

      Table 1  Effect of acid/base concentration on the enantioseparation of rivastigmine

      室温(room temperature);流速(flow rate):1.0 mL/min;其它条件同图1(the other  conditions are the same as in Fig.1)。

      3.2.2  酸性添加剂对手性分离的影响  在优化手性分离的过程中,通过添加相同比例的酸性添加剂(0.02%),初步考察了6种有机酸对分离效果的影响(见表2)。卡巴拉汀在该浓度条件下仅在添加有乙酸或丙酸的流动相中能得到分离。

      3.2.3  流动相中添加有机溶剂的影响  保持流动相中酸碱浓度和比例不变,在甲醇乙酸三乙胺体系中分别加入四氢呋喃(THF)、乙腈(ACN)、乙醇(C2H5OH),考察了添加这些有机溶剂的影响(见表3)。

      表2  酸性添加剂对手性分离效果的影响(略)

      Table 2  Influence of structure of acid additive on the enantioseparation

      NR:未分离(no resolution);流动相(mobile phase):CH3OH∶酸(acid)∶:TEA (100∶0.02∶0.01, V/V); 其它条件同图1(the other  conditions are the same as in Fig.1)。   

      混合流动相中甲醇的含量降低,卡巴拉汀在3类流动相条件下的保留都是减小的,样品分离度变小。从分离效果看,不添加上述溶剂的甲醇乙酸三乙胺体系的分离效果更好。    
      
      表3  流动相组成对手性分离的影响 (略)

      Table 3  Influence of organic solvent on the enantiseparation of rivastigmine

      NR:未分离(no resolution);a流速(flow rate):1.0 mL/min;b 流速(flow rate):0.8 mL/min;a色谱条件见图1(the chromatographic conditions are the same as in Fig.1);ACN: actonitrile; THF: tetrahydrofuran.

      3.3  流动相流速的影响表4是改变流动相流速对分离的影响。结果表明,在考察的流速范围内,降低流速对手性分离是有利的。改变流速,分离因子α几乎无变化。但在低流速下塔板数高,分离度较大。

      3.4  温度的影响控制流速为1.0 mL/min,考察柱温(5℃、10℃、15℃、25℃)对手性分离的影响。根据van′t Hoff方程lnk′=ΔΗ0/RT+ΔS0/R+ln=-ΔH0/RT+ΔS[11],可以得到图3中卡巴拉汀lnk′~1/T(T为绝对温度)关系图。结果表明,卡巴拉汀的保留时间随温度的升高而缩短,柱效增加,但分离度减小。      

      表4  流动相流速对对映体分离的影响a(略)

      Table 4  Effect of flow rates on enantioseparation of rivastigmine hydrochloridea

      a 流速(Flow rate):1.0 mL/min;其它条件见图1(the other conditions are the same as in Fig.1)。

      图3  柱温变化对卡巴拉汀对映体分离的影响(略)

      Fig.3  Effect of column temperature on the enantioseparation of rivastigmine

      流速(flow rate):1.0 mL/min;其它条件同图1(the other  conditions are the same as in Fig.1)。

      由van′t Hoff方程以及GibbsHelmholz 关系式,可推导出色谱手性拆分的分离因子(α)与热力学函数的关系:lnα=ΔΔH0/RT+ΔΔS0/R[11],根据该关系式和van′t Hoff方程可以计算出手性拆分过程中的热力学参数(表 5)。在Chirobiotic V柱上对卡巴拉汀对映体进行手性拆分,其lnα对1/T呈线性关系。该线性关系说明这些热力学参数在实验温度范围内为定值,固定相构型没有发生明显变化,保留机制及对映选择作用不变。从表5看出,卡巴拉汀对映体的手性分离过程的ΔΔΗ0、ΔΔS0为负值,说明该手性拆分过程为焓驱动,后出峰的(R)异构体较前出峰的(S)异构体与固定相存在较强的相互作用,且与固定相形成络合物后分子总体变得更有序,温度升高分离因子下降。ΔΔΗ0的绝对值较小,说明对映体的拆分是在立体位阻的影响下相互作用的微小差别引起的。

      表5  卡巴拉汀在优化的色谱条件下的熵变与焓变a(略)

      Table 5  Enthalpy and entropy of rivastigminea

      a 流速(flow rate):1.0 mL/min;其它条件同图1(the other conditions are the same as in Fig. 1).

    【参考文献】
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