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石榴皮乙酸乙酯提取物对胰岛细胞生长活力的影响

首席医学网      2010年11月23日 10:33:15 Tuesday  
 
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作者:王烨1, 徐永华2, 毛新民1    作者单位:(1新疆医科大学药学院, 新疆乌鲁木齐830011; 2兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验科, 新疆乌鲁木齐830011)

【摘要】  目的研究新疆石榴皮乙酸乙酯提取物对大鼠胰岛细胞生长活力的影响。方法将石榴皮依次用石油醚、氯仿、 乙酸乙酯提取得到石榴皮乙酸乙酯提取物,将阳性对照组、正常对照组及石榴皮提取物不同浓度组与胰岛细胞共同孵育一定时期,分别在不同时间,采用MTT法测定细胞生长活力(OD值)。结果石榴皮乙酸乙酯提取物低、高剂量组与正常对照组相比,细胞生长活力差异有统计学意义(P<0.01)。结论石榴皮乙酸乙酯提取物在体外能显著促进胰岛细胞生长。

【关键词】  石榴皮; 胰岛素; 生长活力; 细胞培养

 Abstract: ObjectiveTo investigate the viability of rat islets through the induction by pomegranatepeels extract (PPE). MethodsPPE was extracted with petroleum ether and chloroform solvents, then re-extracted with ethyl acetate and obtained the ethyl acetate. Then the following experiments have beendone on this extracts. That the islet cells were divided into common control group, Gilemal masculinecontrol group, PPE groups were cultured for different days respectively,then to evaluate theviability of islet cells with the method of MTT. ResultsPomegranate Extract of Ethyl acetate canpromote the growth of islet cells, the viability of islet cells was markedly higher than that ofcontrol group (P<0.01). ConclusionsPEE contribute to improveing the viability of islet cells in vitro.

  Key words: pomegranate peels; insulin; viability; cell cultured

  石榴是新疆的特色果品,含有多种人体所需氨基酸、必需的微量元素和各种维生素,具有祛火、软化血管、养颜等功 效。但体积占石榴20%~30%的石榴皮还未被充分地利用起来,大部分都被废弃,造成严重的资源浪费[1]。新疆维药降糖孜亚比提片在维吾尔医学上用于消渴症引起的尿多、烦渴、疲乏、消瘦等糖尿病症状,并被卫生部药品标准所收录[2]。本课题组研究发现降糖孜雅比提片能显著促进胰岛细胞生长和胰岛素的分泌,并具有一定的保护胰岛细胞功能的作用[3],而石榴皮就是其组方之一。本实验以体外原代培养的胰岛细胞为研究对象,观察石榴皮乙酸乙酯提取物对胰岛细胞生长活力的影响,为新型抗糖尿病药物的研发进行初步探索。

  1实验动物、试剂与仪器

  1.1实验动物1周龄健康Wistar大鼠乳鼠,购于新疆医科大学动物实验中心 (新2003-0001)。

  1.2主要试剂石榴皮提取物(extract of Pomegranate peels,简称EPP)由新疆昌吉卫生学校提供。优降糖(天津太平洋制药有限公司,批号:080105),胶原酶Ⅱ型(Gibco公司),低糖DMEM完全培养液(Gibco公司),D-Hank’s平衡液(自配),胰蛋白酶(Sigma 公司),噻唑蓝(MTT,Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司,批号:080320),双硫棕(DTZ,Sigma公司),台盼蓝(Sigma公司)。

  1.3主要仪器医用净化工作台(上海博迅实业),CO2培养箱(Forma公司),倒置显微镜(CKX41型 Olympus),酶标仪(550 型 美国BIO-RAD),低速大容量多管离心机(LXJ-IIB型 上海安亭科学仪器厂)。

  1.4实验方法

  1.4.1石榴皮提取物的制备称取石榴皮粗粉(过2号筛)1 000 g,置10 000 ml长颈圆底烧瓶中,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行回流提取,最终得到石榴皮乙酸乙酯提取物。

  1.4.2胰岛细胞的制备及培养组织提取:将1周龄Wistar大鼠乳鼠断颈处死,于75%乙醇中浸泡数秒后取出,无菌剖腹取出胰脏[4],于冷D-Hank’s液中漂洗5~8遍,清除脂肪、包膜、血管等胰外组织,转入青霉素小瓶中,剪成0.1~0.5 mm3大小的碎块,从外观看似细纱状。消化分离:加入5~10倍体积的无菌消化酶液,37℃水浴振荡消化30 min后,混匀成细胞悬液,将消化液取出移入离心管中,1 000 r/min离心5 min,弃去上清消化液,加D-Hank’s液至10ml,摇匀后离心5 min(1 000 r/min),将上清液倒去,取沉淀即为消化下的细胞,加入2 ml DMEM培养液,混匀。细胞接种:将细胞悬液接种于24孔培养板中,每孔1 ml,置于37℃ 5%CO2饱和湿度培养箱中培养。纯化:接种18 h后,轻轻振荡培养板,利用细胞生长差速法,将培养液中未贴壁的细胞接入新的培养板中,可除去部分贴壁的成纤维细胞。将新培养板中的细胞继续培养48 h后,更换含有2.5 μg/ml碘乙酸的培养基培养5 h,可除去绝大部分成纤维细胞,而胰岛细胞不受伤害。用不含碘乙酸的培养基洗2次,加入培养液继续培养,每隔3天换培养液,获得单层胰岛细胞,备用。

  1.4.3胰岛细胞形态学鉴定及染色通过染色法于倒置显微镜下观察胰岛细胞形态。取生长良好的单层胰岛细胞,与DTZ  工作液1∶1混合,室温孵育10 min后,光镜下计数[5]。计算胰岛细胞获得率:胰岛细胞获得率=(DTZ阳性细胞/细胞计数总和)×100%。细胞活力的测定用台盼蓝染色法。细胞悬液和0.5%台盼蓝染液按1∶1体积混匀,光镜下计数。凡折光性强而不着色的为活细胞,染上蓝色的为死细胞,细胞活力=(活细胞数/总细胞数)×100%。1.4.4胰岛细胞生物学功能的鉴定胰岛素是胰岛细胞释放的激素,测定胰岛素释放量可以判断胰岛细胞的功能。一般以对葡萄糖的反应性作为胰岛细胞功能的鉴定指标。将原代培养的胰岛细胞接种于24孔培养板中,细胞数调整为2~5×105个细胞/ml,每孔加胰岛细胞悬液1.0 ml,培养至第7天,吸去培养液,每孔分别加入含5.6 mmol/L和27.8mmol/L葡萄糖的D-Hank’s液应激刺激胰岛细胞,置37℃ 5%CO2饱和湿度培养箱中培养4 h,吸取培养液上清,用放射免疫法测定胰岛素含量。

  1.4.5石榴皮乙酸乙酯提取物对大鼠胰岛细胞生长活力的影响(MTT法)将培养3 d的胰岛细胞用胰蛋白酶消化,分为阳 性对照组、正常对照组和石榴皮提取物低、中、高剂量组(浓度分别为 25、50、100 μg/ml)。将上述各组培养液制成含2~5×104个细胞/ml的单细胞悬液,接种于96孔培养板中,每组各设5个复孔,每孔200 μl,并设不含细胞只含培养液的空白调零孔,放入37℃ 5%CO2饱和湿度培养箱中培养,分别培养2、4、6、8、10、12 d后,每孔加入浓度为5 mg/ml的MTT溶液20 μl,继续培养4 h[6],取出培养板,吸出培养液,每孔加入200 μl二甲基亚砜,振荡10min,使结晶物溶解均匀,于酶标仪上490 nm处测定吸收值(OD值),记录结果。

  1.5统计学处理使用SPSS13.0统计软件进行数据的统计、处理、分析。各项数据以均值±标准差(±s)表示,采用One  -Way ANOVA中方差齐性LSD-t检验以及重复测量资料的方差分析,检验水准α=0.05。

  2实验结果

  2.1胰岛细胞形态学鉴定及染色结果倒置显微镜下,胰岛细胞呈橘黄色、半透明、类圆形细胞,胞浆丰富,边缘清晰,有的细胞团边缘有一紫色弧形反光带,细胞团大都松散贴壁,少数悬浮于培养基中,部分细胞团周围有少量纤维细胞爬行。在胰岛细胞原代分离培养到第7~11天胰岛细胞形成良好单层细胞(图1)。DTZ染色结果:光镜下胰岛细胞呈现猩红色,可染率达85%~90%,结果见图2。同时,用台盼蓝染色法测定细胞活力为90%以上,结果见图3。图1原代分离培养大鼠乳鼠胰岛细胞(10×40)图2特异性染色剂DTZ染色胰岛细胞a: DTZ 染色胰岛细胞(10×40); b: DTZ 染色胰岛细胞(10×10)图3台盼蓝染色胰岛细胞(10×10)

  2.2胰岛细胞生物学功能鉴定不同水平的糖溶液刺激胰岛细胞后,胰岛细胞释放的胰岛素水平的差别有统计学意义(P<0.01)。高糖溶液刺激胰岛细胞后胰岛素的分泌量较低糖刺激有显著上升,提示胰岛细胞具有较高的葡萄糖反应性,为后续实验提供了可靠的研究对象。低、高糖刺激的胰岛素水平分别为(27.32±4.12) μU/ml、 (58.52±2.50)μU/ml。高糖刺激与低糖刺激的胰岛素水平的差别有统计学意义(P<0.01)。

  2.3石榴皮乙酸乙酯提取物对胰岛细胞生长活力的影响(MTT法)石榴皮提取物低剂量组与高剂量组及阳性对照组的OD值与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05~0.01),中剂量组的OD值与正常对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。石榴皮乙酸乙酯提取物低剂量组与阳性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)中、高剂量组与阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(表1),说明石榴皮提取物对胰岛细胞生长活力有促进作用。表1石榴皮乙酸乙酯提取物对胰岛细胞生长活力的影响

  3讨论

  MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan),并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。本实验通过MTT法证实石榴皮乙酸乙酯提取物对胰岛细胞生长活力具有促进作用。石榴皮中含有氨基酸、蛋白质、糖及其苷类、酚类和鞣质、有机酸、黄酮类、生物碱、挥发油等化学成分[7],其中的黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类低分子量酚类物质的总称,属植物次级代谢产物,广泛存在于各种植物和大型真菌中,如在银杏叶、山碴、杜仲、山香圆叶、水芹、竹叶、黄芪、丹参等植物中均有检出。在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在,也有以游离形式存在的。黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态(苷和苷元、单糖苷、双糖苷或三糖苷)不同而有很大差异。到目前为止,己经发现有5 000多种植物中含有黄酮类和异黄酮类化合物[8]。大量研究证明,许多黄酮类化合物在治疗糖尿病及其并发症方面疗效显著[9],如黄芪中的主要有效成分黄芪甲甙有刺激胰岛素分泌的作用[10];茴香籽总黄酮降血糖作用可能的途径是刺激胰岛素分泌或拟胰岛素作用[11];水芹黄酮对STZ糖尿病小鼠胰岛损伤有明显保护作用[12];卷柏富含黄酮,其降糖作用与对抗四氧嘧啶对大鼠所致的β细胞损伤,促进β细胞修复和再生密切相关[14]。Parmar等[15]认为石榴皮降血糖作用可能与其多酚类化合物有关。而黄酮化合物在结构上亦属多酚类,因此我们考虑石榴皮乙酸乙酯提取物中的活性成分可能是黄酮类化合物。但也有资料显示,石榴皮、果实和叶中的熊果酸可能为治疗糖尿病的有效成分[15],而石榴皮提取物中降血糖的活性物具体为何种成分还有待进一步研究。

【参考文献】
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  [15]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,1996:619-621.

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