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转录因子7L2(TCF7L2)与2型糖尿病的相关性研究

首席医学网      2010年11月23日 10:31:17 Tuesday  
 
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作者:骆新, 王烨, 张敏芳, 毛新民, 李琳琳    作者单位:(新疆医科大学药学院, 新疆乌鲁木齐830011)

【摘要】  目的探讨环境因素对新疆和田地区吐沙拉乡2型糖尿病(T2DM)和高血压的检出率及危险因素的影响,研究转录因子(TCF7L2)与维吾尔族2型糖尿病的相关性。方法在和田吐沙拉乡进行关于T2DM和高血压的流行病学调查,信息录入数据库进行对比。采用PCR技术,对被筛选出的维族样本的5个单核苷酸的多态性(SNP)基因型中的TCF7L2及等位基因频率在糖耐量正常人群和T2DM患者中进行分析。结果TCF7L2被选SNP的G等位基因和T等位基因在T2DM组和正常糖耐量(NGT)组之间的分布频率差异有统计学意义。GT&TT和GG的基因型在T2DM组和NGT组之间的分布频率差异也具有统计学意义。结论转录因子7L2(TCF7L2)与和田地区维吾尔族T2DM的发病有一定相关性。

【关键词】  多因素; 2型糖尿病; 单核苷酸多态性

 Abstract: ObjectiveTo study detection rate and risk factors about type 2 diabetes mellitus andhypertension in Tusala town Hetian city, make clear the detection rate′s contrast between Uygurs andKazaks. To distinguish which SNPT′s allele will be put in one group, as them on the same pathwayabout T2DM happened or not. MethodsEnter the epidemiology investigation messages in computer, whichfrom Tusala town Hetian city. PCR was used to analyze five SNP, principal component analysis andcluster analysis were used on data handling. ResultsThere was differences between the allele gene Gand T of the chosen SNP. The locate rate of gene GT&TT and GG had significant differences.ConclusionThe factor of environment effects detection rate and risk factors about type 2 diabetesmellitus and hypertension in Tusala town Hetian city.

  Key words: multiple factor; type 2 diabetes mellitus; single nucleotide polymorphism (SNP)

  糖尿病是未被攻克的世界性医学难题之一,因其较高的发病率及病死率已经被列入全球五大危险疾病。随着生活环境  的改变,在快速增长的糖尿病患者群体中,有近90%被诊断为2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM),并且大部分出现在发展中国家,2型糖尿病已经成为位居恶性肿瘤和心脑血管疾病之后的又一严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。2型糖尿病发病机制十分复杂,既与遗传因素有关,又与环境因素有关,是多基因和多种环境因素相互作用的结果。其发病率在不同国家、地区、种族及民族之间有较大差异。新疆维吾尔族T2DM发病率较高,可能与维吾尔民族的生活习惯如喜食牛羊肉等高热量食品以及遗传等因素有关。本课题拟从遗传基因角度进行分析,运用候选基因策略,研究和田地区维吾尔族与哈萨克族2型糖尿病与正常糖耐量人群TCF7L2 rs12255372的G和T等位基因的基因型分布频率。

  1对象与方法

  1.1研究方法

  1.1.1基因组DNA的制备与鉴定EDTA-K2抗凝血约2.5 ml,采用酚-氯仿法提取全血DNA。(1)紫外定量:取5 μlDNA样品以TE缓冲液稀释,紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸光度。A260/A280用于估计模板的浓度,若比值为1.8~2.0,说明样品中核酸较纯;若比值>2.0,说明样品中蛋白质未去除干净;若比值<1.8,说明有RNA污染。(2)电泳鉴定:取2 μl模板DNA于0.7%琼脂糖凝胶进行电泳,80 V电压40 min,凝胶成像仪照像。

  1.1.2PCR扩增及基因型判读采用聚合酶链反应-限制性内切酶酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)和ARMS-PCR。

  1.1.3单核苷酸多态性位点(SNP)TCF7L2PCR扩增体系预实验部分共选了7 对引物,引物序列及其解链温度如下:(1)  A1上游:CTGGCTTGGAAAGTGTA,Tm: 52.18℃,A2下游:CTGATGGTTGAATGTG,Tm:52.18℃。(2)B1上游:  TTGTCCCTTGAGGTGTA,Tm:52.18℃,B2下游:CTGATGGGTTGAATGTG,Tm:52.18℃。(3)C1上游: TGGAAACTAAGGCGTGAGGG,Tm:59.85℃,C2下游: GGGCTGATGGGTTGAATGTG,Tm:59.85℃。(4)D1上游:  ATCCAGGCAAGAATGAC,Tm: 52.18℃,D2下游:GAGGCTGTTACAAAGGT, Tm:52.18℃。(5)E1上游:  TATCCAGGCAAGAATGAC,Tm:52.74℃,E2下游:CACGCTTTGAAGGTAGAG Tm: 55.02℃。(6)F1上游:  TGGCTTGGAAAGTGTAT,Tm:49.77℃,F2下游: CTGATGGGTTGAATGTG,Tm:52.18℃。(7)G1上游: ATCCAGGCAAGAATGAC,Tm: 52.18℃,G2下游:GAGGCTGTTACAAAGGT,Tm:52.18℃。1.1.47对引物对TCF7L2 PCR体系循环参数结果表明实验引物设计使用程序合理,见表1。表1TCF7L2 PCR体系循环参数图TAGA,Tm:52.18℃(表2)。表2TCF7L2 PCR体系循环参数图

  1.2研究对象在当地稳定居住达20年以上的常驻人口,三代直系亲属均为维吾尔族,年龄≥30周岁,性别不限。采集 自和田地区医院的T2DM已知病例,要求病程、用药史清晰。

  1.2.1分组与判定标准(1)正常糖耐量组(Normal Glucose Tolerance, NGT):来源于和田市吐萨拉乡自然人群中正常体检者55例,均为维吾尔族。要求彼此无血缘关系,三代以内均为维吾尔族。空腹8~12 h后,测定肘正中动脉血糖小于5.6 mmol/L者;若空腹血糖(Fasting Blood Glucose, FBG)5.6~7.0 mmol/L,进行口服糖耐量试验(Oral Glucose Tolerance Test, OGTT),2 h后准时测定右手食指指尖血糖,2 h后血糖(2 Hours Fasting BloodGlucose, 2FBG)<7.77 mmol/L者。(2)糖耐量减低组(Impaired Glucose Tolerance, IGT):共19例,均为维吾尔族。对初筛FBG5.6~7.0 mmol/L者,均进行OGTT,2 h后准时测定右手食指指尖血糖,2FBG7.77~11.1 mmol/L者判定为糖耐量减低组(IGT)。(3)T2DM组(T2DM):选取和田地区人民医院内分泌和干一科的T2DM住院病人共19例,均为维吾尔族,FBG≥7.0 mmlo/L或者2 h后血糖(2FBG)>11.1 mmol/L。

  1.3仪器与药品

  1.3.1仪器Anke TGL-16G台式高速离心机、ESJ-180-4电子天平、DNP9082电热恒温水浴箱、高压灭菌箱、SmartSpec3000紫外分光光度仪、Cintra 10e紫外分析仪、Cycler和PERKIN ELMER Gene Amp PCR system 2400扩增仪、LKB-2117稳压电泳仪、BIO-RAD凝胶分析仪均由新疆维吾尔自治区地方病暨分子生物学重点实验室提供。

  1.3.2PCR-RFLP所用试剂浓度10×buffer缓冲液,MgCl2 25 mol/L,dNTPs10 mol/L,上下游引物工作液20 pmol/μl,Taq DNA聚合酶5 U/μl,等。以上试剂购自上海生工生物工程公司。

  1.4统计学处理应用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析,基因型和等位基因分布频率用四格表卡方检验,检验水准α  =0.05。

  2结果

  TCF7L2 rs12255372的G等位基因和T等位基因在T2DM组和NGT组的分布频率差异有统计学意义。GT&TT和GG的基因型在T2DM组和NGT组的分布频率差异也具有统计学意义,见表3。表3TCF7L2被选位点基因型和等位基因分布频率

  3讨论

  最新一项研究对英国的6 736例病例研究分析发现,TCF7L2是2型糖尿病的新的易感基因,并且对个体患2型糖尿病有 着潜在的影响,TCF7L2还可能与机体糖刺激后胰岛素分泌功能相关[1]。TCF7L2中对2型糖尿病存在至关重要影响的单核苷酸多态性位点在各地区、各民族间有着一定程度的差别[2]。例如在英国人中发现了4个单核苷酸多态性位点,在芬兰人[3]、冰岛人、美国人[5]、丹麦人中发现了5个单核苷酸多态性位点,已经被确认为与2型糖尿病有关,其中有2个基因片段序列为rs12255372的T等位基因和rs7903146的T等位基因位点在最近的研究中被认为是关键位点,除此之外的其余12个单核苷酸多态性位点与2型糖尿病的发生关系不是很大。在美国人中还发现TCF7L2及其片段上游部位与2型糖尿病密切相关[6]。可以确认在TCF7L2中的10q染色体部位与2型糖尿病相关。最近在法国人群中对TCF7L2的基因学研究表明人类的β细胞和脂肪组织与2型糖尿病也有密切的关系[4]。本研究结果显示,维吾尔族TCF7L2 rs12255372的G等位基因和T等位基因在T2DM组和NGT组的分布频率差异有统计学意义。GT&TT和GG的基因型在T2DM组和NGT组的分布频率差异也具有统计学意义。由此可见,如果能够依据遗传标记寻找出糖尿病的易感人群,并尽早给予环境干预,将有可能减少或减缓糖尿病的发病。

【参考文献】
   [1]Christopher J, Groves, Zeggini E, et al. Analysis of 6,736 U.K. Subjects provides replication andconfirms TCF7L2 as a type 2 diabetes susceptibility gene with a substantial effect on individual risk[J]. Diabetes, 2006, 55: 2640-2644.

  [2]Grant SF, Thorleifsson G, Reynisdottir I. et al. Variant of transcription factor 7-like 2(TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes[J].Nat Genet, 2006, 38: 320-323.

  [3]Laura J, Scott L, Bonnycastle N, et al. Association of transcription factor 7-Like 2 (TCF7L2)variants with type 2 diabetes in a finnish sample[J].Diabetes, 2006,55: 2649-2653.

  [4]Cauchi S,Meyre D,Dina C,et al.Transcription factor TCF7L2 genetic study in the frenchpopulation: Expression in human [beta]-cells and adipose tissue and strong association with type 2diabetes[J].Diabetes, 2006, 55: 2903-2908.

  [5]Zhang C, Qi L, Hunter DJ, et al. Variant of transcription factor 7-Like 2(TCF7L2) gene and therisk of type 2 diabetes in large cohorts of U.S. women and men[J].Diabetes,2006,55: 2645-2648.

  [6]Hunt KJ, Lehman DM, Arya R. Genome-wide linkage analyses of type 2 diabetes in MexicanAmericans: the San Antonio Family Diabetes/Gallbladder Study[J]. Diabetes, 2005, 54: 2655-2662.

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