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NMR结合主成分分析(PCA)可以较好地呈现出不同空腹血糖水平人群的尿液代谢物特征

首席医学网      2010年11月23日 10:30:16 Tuesday  
 
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【关键词】  2型糖尿病; 尿液代谢成分; 核磁共振; 主成分分析

 Abstract: ObjectiveTo determine urinary metabolic profile in diabetes mellitus in population of Uygurand Kazak, and to explore the application of nuclear magnetic resonance spectroscopy-based method toinvestigate the pathogenesis of diabetes mellitus. ethodsThe urine samples were collected incentrifuge tubes of 50 ml and frozen in refrigerator of -20℃. Preparation of NMR samples: the sampleswere defrosted in 4℃, aliquots of 550 μl urine samples were made up to 600 μl with 50 μlphosphate buffer and any precipitate removed by centrifugation. 550 μl of supernatant weretransferred to 5 mm NMR tubes and their 1H NMR spectra were acquired, and then subjected to dataprocess and principal components analysis. ResultsThis study demonstrated obvious metabolic urinarydifferences between T2DM group and NFG group in the two nations, and the metabolites changed weremainly glucose and creatinine. According to the average spectra, there was an increase in taurine,glucose etc and a decrease in creatinine, hippurate, DMA, acetate, for mate in T2DM group of Uygur andKazak; the concentration of citrate and lactate in IFG group of Uygur was higher than that of T2DMgroup. There was a remarkable increase in glucose in T2DM group of Kazak, but minor changes in lactate  and citrate. Conclusion1H NMR combined with PCA is a good research method to investigate the urinarymetabolic profile in population of the different degree of fasting blood glucose.

  Key words: type 2 diabetes mellitus; urinary metabolites; nuclear resonance spectroscopy; principalcomponent analysis

  近几十年来,随着生活水平的提高、生活方式的改变和人口老龄化,糖尿病(diabetes mellitus, DM)患病率在世界范围内呈上升趋势。第五届国际糖尿病联盟西太区会议上的统计数字显示,全球已确诊糖尿病患者达1.5亿人,预计2025年全球糖尿病患者将突破3亿,我国糖尿病患者总数将近1亿[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合征,持续的高血糖可导致神经系统、心血管系统和眼睛、肾脏等重要脏器的慢性进行性病变,最终引起功能缺陷、衰竭,甚至发生急性代谢紊乱[2]。因此,糖尿病已经成为全球的重大公共卫生问题。我国流行病学研究发现,高动物脂肪、高糖所致的高热量摄入与餐后2 h血糖水平呈正相关,而维生素、蔬菜、豆类制品等与血糖水平呈负相关[1,3]。本课题组曾对维吾尔族(维族)、哈萨克族(哈族)两民族T2DM患病率进行了流行病学调查,结果显示饮食结构以高脂肪、高蛋白膳食的伊犁地区哈族聚居的2个县T2DM检出率分别为0.94%和2.36%[4],而以蔬菜、水果为主的喀什恰萨乡维族T2DM检出率高达14.00%[5],此调查结果与上述饮食和血糖水平的相关性论点相矛盾,驱使我们拟进一步展开深入研究。本研究以新疆维族、哈族糖尿病患者生物体液(尿液)为研究对象,旨在初步研究维族、哈族两民族糖尿病人群尿液代谢成分的特征,探讨核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术在糖尿病发病机制中的应用。

  1材料与方法

  1.1仪器和试剂

  1.1.1仪器Bruker DRX 500核磁共振仪(Bruker Biospin, Rheinstetten Germany);Anke TGL-16G台式高速离心机;5 mm核磁管由中科院武汉分院物理与数学研究所暨国家重点实验室-武汉磁共振中心提供。1.1.2试剂重水( deuterium oxide ,D2O)购自Cambridge Is tope Laboratories inc;2,2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸钠 Sodium〔3-trimethyl-silyl-[2,2,3,3-2H4] propionate,TSP〕购自Sigma-Aldrich inc.(ST.Louis.MO.U.S.A) ;磷酸盐缓冲液(1.5 M K2HPO4-NaH2PO4,pH7.47)。

  1.2样本来源根据WHO1999年发布的糖尿病诊断标准[6]将调查人群分为3组:空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG) <6.1 mmol/L为正常空腹血糖(normal fasting glucose,NFG),6.1 mmol/L≤FPG<7.0 mmol/L为空腹血糖受损(impaired fasting glucose,IFG),FPG≥7.0 mmol/L为T2DM。哈族人群尿样来源于乌鲁木齐市达板城区阿克苏乡的6个村和阿勒泰市布尔津县哈族聚居区,共411例,其中T2DM 26例,IFG 24例,NFG 361例;维族人群尿样来源于乌鲁木齐市三工社区健康体检人群及乌鲁木齐市六十七中学健康体检人群,共62例,其中T2DM 8例,IFG 6例,NFG48例。

  1.3方法

  1.3.1尿样的收集与处理 收集尿液存于50 ml接尿管(内加1 ml浓度为1%NaN3溶液)中,置于-20℃冰箱中保存备用。NMR测量前样品准备:尿液于4℃解冻,摇匀,在550 μl尿液中加入55 μl磷酸盐缓冲液(1.5 mol/L K2HPO4-NaH2PO4,pH7.47),摇匀,4℃离心10 min(10 000 r/min),取上清液550 μl转入直径5 mmNMR样品管中进行测试。

  1.3.2NMR数据的采集将处理好的尿样转入5 mmNMR样品管中后直接在Bruker DRX 500核磁共振仪上进行采样,获得原始的1H NMR。所有光谱的采集都是在298 K的室温下进行的。采用有预饱和的noesypr1d脉冲序列,取如下参数:谱宽  10 000 Hz(20 ppm),混合时间0.1 s,弛豫延迟时间2 s,采样点数32 K,数字变换点数64 K,累加次数32次;核磁共振仪实际工作频率为500.13 MHz。在弛豫延迟期间采用预饱和方式抑制水峰,谱仪偏置设置在水峰的位置。所有样本的自由感应衰减信号(Free induction decay,FID)导入Bruker Topspin 2.0软件经过傅立叶变换(Fouriertransform,FT),从而获得1 D NMR谱图,所用窗函数为1.0 Hz线增宽因子。

  1.3.3NMR数据的分析

  1.3.3.1原始1H NMR平均谱分析 为了消除样本间的个体差异,需要对NMR谱进行分段积分,积分区间一般为0.002ppm或0.001 ppm,在500 MHz谱仪上对应于1 Hz或0.5 Hz。积分区间越小,平均谱就越接近原始1H NMR。本实验按照化学位移δ0.2~10.0 ppm,积分区间为0.001 ppm进行分段并积分。去除水峰和尿素峰(δ4.3~6.5 ppm) 并将包含葡萄糖峰的部分(δ4.64~4.67 ppm,δ5.23~5.243 ppm)重新积分后放入原有积分数据中,将积分值归一化后求出平均值并导入Excel中求出平均谱后进行分析。

  1.3.3.2主成分分析(principal components analysis,PCA)将所获得的谱图进行相位校正、基线校正,以TSP为化学位移参考峰的位置,并定为0。按照化学位移δ 0.2~10.0 ppm,每段为0.04 ppm范围进行分段并积分[7], 同时排除以水峰为中心的部分和包含尿素峰的部分(δ 4.3~6.5 ppm) ,并将包含葡萄糖峰的部分(δ 4.64~4.67 ppm,δ 5.23~5.243 ppm)重新积分后放入原有积分数据中,将所产生的所有积分数据归一化,以文本文件或Excel文件贮存,用于PCA。将积分值进行中心化和比例换算后,用SIMCA-P10.0(Umetrics AB,Umea,Sweden) [8]软件进行PCA,利用主成分(principal components,PC)对各组尿液的代谢成分进行分析。

  2结果

  2.1维族NFG、IFG、T2DM 3组之间比较

  2.1.1维族NFG、IFG、T2DM 3组1H NMR平均谱比较图1表明,维族T2DM组与NFG组相比,尿样中牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖等代谢物的含量有升高的趋势;而肌酐、马尿酸、二甲胺、乙酸、甲酸等代谢物的含量有降低的趋势。维族IFG与NFG相比,尿样中乳酸、柠檬酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖的含量有升高的趋势[9]。

  2.1.2维族NFG、IFG、T2DM 3组PCA结果如图2所示,维族T2DM(■)、IFG(●)、NFG(▲)组各样本沿第一主成分分布,  大多数样本没有重叠,表明各样本代谢谱之间是有差别的(图中的每一个点代表一个样本)。图3表明,葡萄糖和肌酐的含量变化在维族NFG、IFG、T2DM 3组中不一致。图4表明,大多数点集中在原点附近,只有少数点远离原点,正是这些点所代表的化合物造成了NFG、IFG、T2DM组间的差异。

  2.2哈族NFG、IFG、T2DM 3组之间比较

  2.2.1哈族NFG、IFG、T2DM 3组1H NMR平均谱比较图5表明,哈族T2DM组与NFG组相比,T2DM组尿样中牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖等代谢物的含量高于NFG组;而肌酐、马尿酸、二甲胺、乙酸、甲酸等代谢物的含量低于NFG组。哈族IFG组与NFG组相比,IFG组尿样中乳酸、柠檬酸的含量未见明显差异,而α-葡萄糖、β-葡萄糖的含量升高较为明显 。

  2.2.2哈族NFG、IFG、T2DM 3组PCA结果如图6所示,哈族NFG(▲)、IFG(●)、T2DM(■)组各样本沿第一主成分分布, 大多数样本没有重叠,表明各样本代谢谱之间是有差别的。图7表明,主要是葡萄糖和肌酐的含量变化在哈族NFG、IFG、T2DM 3组中不一致。图8表明,大多数点集中在原点附近,只有少数点远离原点,正是这些点所代表的化合物造成了NFG、IFG、T2DM组间的差异。图1维族NFG(绿色)、IFG(蓝色)、T2DM(红色)3组1H NMR平均谱比较图2维族NFG、IFG、T2DM 3组PCA得分图图3维族NFG、IFG、T2DM 3组PCA负载图图4维族NFG、IFG、T2DM 3组PCA散点图图5哈族NFG(绿色)、IFG(蓝色)、T2DM(红色)3组1H NMR平均谱比较图6哈族NFG、IFG、T2DM 3组PCA得分图

  2.3维族、哈族NFG组2组之间比较

  2.3.1维族、哈族NFG组2组1H NMR平均谱比较如图9所示,维族、哈族NFG组2组1H NMR平均谱比较未见明显差异。

  2.3.2维族、哈族NFG组2组PCA得分图比较结果如图10所示,维族、哈族NFG组2组之间沿PC1和PC2方向都未能区分开,说明这2组代谢物的种类和含量可能没有明显差异。

  2.4维族、哈族IFG组2组之间比较

  2.4.1维族、哈族IFG组2组1H NMR平均谱比较如图11所示,维族IFG组柠檬酸含量明显高于哈族IFG组,其它物质含量  未见明显差异。

  2.4.2维族、哈族IFG组2组PCA得分图比较结果如图12所示,维族、哈族IFG组2组之间沿PC1和PC2方向都未能区分开,说明这2组代谢物的种类和含量可能没有明显差异。图7哈族NFG、IFG、T2DM 3组PCA负载图图8哈族NFG、IFG、T2DM 3组PCA散点图图9维族(紫色)、哈族(绿色)NFG组2组1H NMR平均谱比较图10维族(■)、哈族(▲)NFG组2组PCA得分图比较图11维族(蓝色)、哈族(紫色)IFG组2组1H NMR平均谱比较图12维族(■)、哈族(▲)IFG组2组PCA得分图比较

  2.5维族、哈族T2DM组2组之间比较

  2.5.1维族、哈族T2DM组2组1H NMR平均谱比较如图13所示,维族T2DM组柠檬酸、乙酸、乳酸、马尿酸含量高于哈族T2DM组,其它含量有差异的物质目前尚未归属出来。

  2.5.2维族、哈族T2DM组2组PCA得分图比较如图14所示,维族、哈族T2DM组2组之间沿PC1和PC2方向都未能区分开,说明这2组代谢物的种类和含量可能没有明显差异。图13维族(红色)、哈族(兰色)T2DM组2组1H NMR平均谱比较图14维族(■)、哈族(▲) T2DM组2组PCA得分图比较

  3讨论

  由维族、哈族两民族不同FPG人群尿液的1H NMR及综合PCA分析可知,葡萄糖、肌酐等主要代谢物的峰改变最为明显,其中T2DM组葡萄糖含量明显升高,肌酐含量明显降低,而其他代谢产物也有不同程度的变化。维族T2DM组与NFG组相比尿样中牛磺酸、葡萄糖含量高于NFG组,而肌酐、马尿酸、二甲胺、乙酸、甲酸等代谢物含量低于NFG组;维族IFG  组与NFG组相比尿样中柠檬酸、乳酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖的含量高于NFG组。哈族T2DM组与NFG组相比,T2DM组尿样中牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖等代谢物的含量高于NFG组;而肌酐、马尿酸、二甲胺、乙酸、甲酸等代谢物的含量低于NFG组。哈族IFG组与NFG组相比,IFG组尿样中乳酸、柠檬酸的含量未见明显差异,而α-葡萄糖、β-葡萄糖的含量升高较为明显 。其中乳酸、柠檬酸等与三羧酸循环能量代谢及糖酵解途径密切相关,还有一些1H NMR峰有变化的代谢产物有待结合二维氢谱进一步确定,这些代谢产物的变化有可能说明人体尿液代谢成分特征分析能够较好地反映T2DM的特征。

  目前本课题组对新疆维族、哈族T2DM的研究是从基因、肠道菌群等不同角度入手的。本研究从代谢产物入手对维族、哈族T2DM的尿液代谢成分特征进行了初步分析,试图找到维族、哈族两民族不同空腹血糖水平人群的尿液代谢物的特征及两民族尿液代谢物之间的差异。从本研究可以初步看出,维族、哈族两民族NFG、IFG、T2DM 3组之间民族内的比  较其代谢产物有一些差异,民族之间的比较尚未找到明显差异。考虑到分析的对象仅限于两民族流行病调查所搜集的样本,而且NMR技术有灵敏度低固有的缺点,因此对于代谢产物较为复杂的尿样可以采用LC-MS联用技术。NMR和LC- MS相互补充是代谢组学研究中最重要的2种技术手段。所以本研究只是作为探究人体尿液代谢成分特征与复杂原因性疾病发病关系的尝试。维族、哈族两民族民族内及民族间与T2DM发生相关的差异代谢物,需要进行更大规模的研究。

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