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VEGF和CyclinD1在乳腺癌中的表达及其意义

首席医学网      2010年11月23日 10:49:38 Tuesday  
 
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作者:简娜提·阿不力孜1, 拉莱·苏祖克1    作者单位:(新疆医科大学1基础医学院病理学教研室, 2第五附属医院普外科, 新疆乌鲁木齐830011)

【摘要】  目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)、细胞周期期素1(CyclinD1)在乳腺癌中的表达,分析其在乳腺癌发生、发展中的作用及二者与乳腺癌临床各参数间的关系。方法应用SP免疫组化法检测VEGF和CyclinD1在60例乳腺癌、21例非典型增生、10例正常对照组石蜡包埋组织中的表达。结果VEGF、CyclinD1的表达在乳腺癌组、非典型增生组及正常对照组间差异有统计学意义(P<0.01);轻度非典型增生组与中重度非典型增生组间VEGF阳性表达差异具有统计学意义(P<0.05)。VEGF的阳性表达与年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期、腋淋巴结转移情况、ER、PR情况无关(P>0.05)。CyclinD1的表达与腋淋巴结转移情况有关。乳腺癌组织VEGF和Cyclind1两者表达呈正相关(r=0.289,P<0.05)。结论VEGF和CyclinD1在非典型增生及乳腺癌中的异常表达提示其与肿瘤的发生、发展密切相关,联合检测VEGF和CyclinD1有可能成为乳腺癌早期诊断及预后的重要指标。

【关键词】  血管内皮生长因子; 细胞周期素1; 乳腺癌; 乳腺非典型增生

 Abstract: ObjectiveTo investigate the expression of VEGF and CyclinD1 in breast ductal atypicalhyperplasia and breast carcinoma, to analyze the significance of vascular endothelial growthfactor (VEGF) and CyclinD1 in breast cancer development and its correlations with some clinicalparameters. MethodsSP immunohistochemistry was used to detect the expression of VEGF, CyclinD1 andcompared among tumor specimens of breast carcinoma (n=60) and breast ductal atypical hyperplasia(n=21) and normal breast tissue (n=10). ResultsThe positive rates of VEGF and CyclinD1 in breastcarcinoma was higher than that in normal breast tissue and in breast ductal atypicalhyperplasia (P<0.01). CyclinD1 was positively related to lymph node transfer. There wassignificant correlation between VEGF and CyclinD1 in breast carcinoma (r=0.289,P<0.05).ConclusionAbnormal expression of VEGF, CyclinD1 in breast ductal atypical hyperplasia, breastcarcinoma indicate what were related occurring and development.It was useful to diagnose earlyand forecast development of breast carcinoma by combining to examine.

  Key words: vascular endothelial growth factor(VEGF); Cyclind1; breast cancer; breast ductalatypical hyperplasia

  乳腺癌( breast cancer )是世界范围内严重危害女性健康的恶性肿瘤。分子生物学研究发现乳腺癌的发生、发展是一个多因素共同参与多阶段的生物学过程,细胞周期调控失常和肿瘤血管生成是其发生、发展中的两个重要方面。血管内皮生长因子(VEGF)是血管形成过程中最重要的因子。细胞周期素1(Cyclin D1)是调控细胞周期G1期细胞增殖的关键蛋白,已证实其过度表达与多种肿瘤细胞的旺盛分裂有关,是一种被公认的原癌基因[1]。本研究采用免疫组织化学方法检测乳腺非典型增生和乳腺癌中VEGF、Cyclindl的表达,旨在探讨2种蛋白在乳腺肿瘤中表达的临床意义及相关性。

  1材料与方法

  1.1标本来源随机选取新疆医科大学第五附属医院病理科(1999~2008年)乳腺组织手术标本91例,平均年龄43.5岁, 所有病例术前均未采取放化疗。10例正常乳腺组织作为对照组,非典型增生组21例(其中轻度增生10例,中重度增生11例), 乳腺癌组60例。以上标本均经临床和组织病理诊断证实。 对60例乳腺癌根据2002年国际抗癌联盟(UICC)乳腺癌TNM分期和2003年WHO乳腺病理学及遗传学分类标准进行分类:TNMⅠ期13例, Ⅱ期44例,Ⅲ期3例。组织学分级:Ⅰ级22例,Ⅱ级25例, Ⅲ级13例。≥50岁者32例,<50岁者28例;肿瘤直径:≤2 cm 28例,2~5 cm 29例,>5 cm3例;腋淋巴结有转移18例,无转移42例;ER(+)47例,ER(-)13例;PR(+)43例,PR(-)17例。

  1.2试剂一抗分别为鼠抗人VEGF单克隆抗体、兔抗人Cyclind1克隆抗体,均为即用型工作液(由福州迈新生物技术开发有限公司提供)。二抗采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)试剂盒(购自迈新公司)。

  1.3方法选取组织标本均经10%中性甲醛固定,石蜡包埋, 3 μm厚连续切片, VEGF和Cyclind1蛋白的表达采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶法(SP法)免疫组织化学染色法检测。免疫组化步骤严格按SP试剂盒说明书操作,3 μm厚切片经常规脱腊至水化,放入盛有Tris-EDTA(pH9.0)液的容器中,微波抗原修复, 室温冷却30~40 min,滴加即用型工作液一抗,4℃孵育过夜,次日滴加即用型生物素标记二抗,室温孵育20 min,滴加DAB显色剂,苏木素复染细胞核,脱水,透明,封片。以上各步骤间均用PBS缓冲液(pH7.6)漂洗3 min×3次。用PBS代替一抗做阴性对照,已知乳腺癌阳性片做为阳性对照。

  1.4染色结果判断显微镜下观察,VEGF阳性染色主要在细胞胞浆,部分在血管内皮细胞中表达,呈弥漫或散在棕黄色  颗粒状;CyclinD1蛋白阳性染色主要在细胞核,呈棕黄色。阳性反应判定标准依据阳性细胞数和阳性反应强度2项指标:阳性着色细胞数>10%定为阳性表达;阳性反应强度以浅黄色为弱阳性(+),黄色或棕黄色为中等阳性(++), 棕色或者深棕色为强阳性(+++),无棕黄色或与背景着色一致为阴性。

  1.5统计学处理应用SPSS13.0软件包分析资料,不同组间比较采用χ2检验及Pearson相关性分析, 检验水准α=0.05。

  2结果

  2.1VEGF在对照组、非典型增生组及乳腺癌组中的表达情况对照组、非典型增生组及乳腺癌组VEGF的阳性表达率分别  为0.00%、66.66%、75.00%。对照组与各组差异有统计学意义(P<0.01);非典型增生组(66.66%)与乳腺癌组(75.00%)阳性表达差异无统计学意义(P>0.05);轻度非典型增生组(40.00%)与中重度非典型增生组(90.90%)间VEGF阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05),见表1。表1VEGF在对照组、非典型增生组及乳腺癌组中的表达情况

  2.2CyclinD1在对照组、非典型增生组及乳腺癌组中的表达情况对照组、非典型增生组及乳腺癌组CyclinD1的阳性表达率分别为0.00%、85.71%、75.00%,对照组与各组差异有统计学意义(P<0.01);非典型增生组(85.71%)与乳腺癌组(75.00%)阳性表达差异无统计学意义(P>0.05);轻度非典型增生组(80.00%)与中重度非典型增生组(90.90%)CyclinD1阳性率表达差异无统计学意义(P>0.05),见表2。表2CyclinD1在正常对照组、非典型增生及乳腺癌组中的表达情况

  2.3VEGF、CyclinD1与临床参数的表达关系VEGF与CyclinD1蛋白在乳腺癌各临床参数组中的表达不同, VEGF蛋白的阳  性表达率在不同年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期、腋淋巴结转移及不同ER、PR表达各组间差异无统计学意义  (P>0.05)。CyclinD1蛋白在有淋巴结转移的癌组织中阳性表达率为94.44%,高于无淋巴结转移的癌组织中阳性表达率(66.67%),差异有统计学意义(P<0.05),与不同年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期及不同ER、PR表达无关(P>0.05),见表3。表3乳腺癌各临床参数与CyclinD1和VEGF的表达关系

  2.4VEGF与CyclinD1在乳腺癌中的共同表达在60例乳腺癌中,VEGF和CyclinD1均阳性者37例,均阴性者7例,两者表达 呈正相关(r=0.289,P<0.05)。

  3讨论

  3.1VEGF与乳腺癌的关系VEGF是目前发现的刺激肿瘤血管形成的最关键因子,在肿瘤血管生成过程中发挥核心作用。 VEGF能促进血管内皮细胞分裂增生,增加血管的通透性,促进纤维蛋白的排出。有关研究证实VEGF在乳腺癌中起着重要作用,从不典型增生到原位导管癌的转化过程中都能检测到VEGF,表明它的表达先于乳腺癌的浸润和转移[2]。本研究结果显示,VEGF在非典型增生和乳腺癌组中阳性表达率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),可以推测VEGF的表达可能在乳腺癌的发生和发展中发挥了一定的作用,还说明从不典型增生到乳腺癌都能检测到VEGF,这与文献[2]研究结果一致。本研究结果还显示,VEGF的表达与乳腺不典型增生的组织学分级有关,VEGF的阳性率随着组织学分级的上升而上升,因此推测在乳腺癌的发生过程中仍然保持着VEGF的过表达,并反映了一个相对早期的情况。在乳腺癌VEGF表达与淋巴结转移的研究结果报道不一致。曾谷清等[3]研究结果表明,VEGF在乳腺癌中呈高表达,并与组织学分级及淋巴结转移密切相关,与患者年龄、肿瘤大小、绝经状况、ER、PR的表达无关。许进等[4]研究证实,乳腺癌中VEGF的表达与淋巴结转移与否关系不大。Stimpfl等[5]研究结果表明,尽管乳腺癌和卵巢癌患者血中VEGF水平较高,但VEGF的水平和变异体的类型不能作为评判肿瘤侵袭行为和恶性程度的指标。本研究结果显示,乳腺癌中VEGF蛋白表达与不同年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期、腋淋巴结转移情况及ER、PR表达无关。这些矛盾现象的原因可能为:(1)由于病理切片检查的淋巴结有限,某些微小的转移可能被忽略,导致假阴性;(2)乳腺癌的发生、发展是一个长期过程,手术切除的当时仅是当时的一个时点,该时点的淋巴结状态不能完全代表细胞生物学表型及转移潜能,也不能反映日后的发展动态。同时也可能与检验方法、样本量的选择等有关系。

  3.2细胞周期素1与乳腺癌的关系CyclinD1是调控细胞周期G1期细胞增殖的关键蛋白。在正常细胞周期中,细胞周期素  CyclinD1与细胞周期素依赖激酶CDK4形成复合物CyclinD1/CDK4,使PRb磷酸化,由此解除了Rb这种抑癌基因调控G1期  停滞的作用,使Rb失去抑制转录因子E2F启动DNA合成的功能,使细胞周期从G1期进入到S期,细胞增殖。CyclinD1过度表达能缩短G1 期,促进细胞提前进入S期,引起细胞生长失控、转化和癌变。CyclinD1过度表达已证实与多种肿瘤细胞的旺盛分裂有关,是一种被公认的原癌基因[1]。现已证实CyclinD1参与多种实体瘤的分子病理机制,其中最有临床意义的是乳腺癌,50%乳腺癌过表达CyclinD1。CyclinD1蛋白在乳腺癌的发生、发展中的机制可能是:CyclinD1过表达能缩短G1期,促使细胞提前进入S期,引起细胞生长失控、转化和癌变。乳腺癌中CycinD1的表达国内外报道不一致。胡向阳等[6]用免疫组织化学的方法检测发现乳腺癌中CycinD1表达阳性率显著高于良性乳腺组织,CycinD1表达出现于导管内癌并持续于浸润转移等过程中,与年龄、肿瘤大小、组织学类型及临床状态无相关性,但与组织学分级呈负相关。本研究结果显示,CyclinD1在非典型增生组和乳腺癌组中阳性表达率均较对照组高,这表明CyclinD1在乳腺癌发生、发展过程中有不可替代的关键作用,与胡向阳等[6]研究结果一致。O′Connor等[7]报道CyclinDl在乳腺癌中的过表达与预后呈正相关。本研究结果显示CyclinD1蛋白的表达与年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期及ER、PR表达无关,淋巴结转移的乳腺癌组织中阳性表达率高于无淋巴结转移的癌组织,提示CyclinD1的过表达对乳腺癌的病理诊断、预后判断有重要的临床意义。Barnes等[8]的研究表明, CyclinD1表达在区分非典型导管增生及高分化导管内癌中有重要作用,发现CyclinD1异常表达可能是乳腺癌发生的一个早期事件,参与乳腺癌的发生、发展,有助于临床从分子水平鉴别原位癌与非典型增生,并可能在针吸细胞学检测中成为恶性诊断的指标。本研究结果显示,非典型增生组CyclinD1过表达较对照组高,与乳腺癌无差别,表明CyclinD1蛋白过表达发生于恶性组织学改变之前,与Barnes等[8]研究结论一致。说明CyclinD1蛋白过表达可能是乳腺癌发生的早期事件,意味着CyclinDl是临床筛选癌前病变的较好指标。

  3.3VEGF和细胞周期素1与乳腺癌本研究采用免疫组织化学方法检测乳腺非典型增生和乳腺癌中VEGF、CyclinD1的表,结果表明,乳腺癌中VEGF和CyclinD1两者表达呈正相关(r=0.289,P<0.05)。提示VEGF与CyclinD1在乳腺癌演进过程中有协同作用。因此可见,CyclinD1不仅是肿瘤发生的早期事件,而且参与了肿瘤的新生血管形成及肿瘤的浸润转移。肿瘤的侵袭和转移可被与肿瘤发生有关的基因(癌基因)调节。罗祥基等[9]研究表明,有的癌基因可通过编码血管生长因子或通过刺激肿瘤细胞间接产生血管生长因子及蛋白酶产生促进肿瘤血管形成,从而影响肿瘤的转移及预后。本研究结果显示,CyclinD1过度表达与淋巴结转移有关。Pai等[10]发现CyclinD1可诱导血管内皮细胞增殖和生长。Holnthoner等[11]亦发现CyclinD1能促进血管形成。Shintani等[12]认为CyclinD1过度表达可通过上调VEGF表达,下调Fas表达来提高食管肿瘤细胞的恶性度,即CyclinD1可能通过VEGF的机制影响肿瘤的浸润转移来影响预后。检测乳腺癌组织中的CyclinD1与VEGF的表达不仅有助于乳腺肿瘤的早期诊断,可能还有助于预测预后。有可能通过下调CyclinD1与VEGF的表达或拮抗其作用来治疗乳腺癌。

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  [3]曾谷清,周秀田,程爱兰,等.P16蛋白和VEGF在乳癌组织中的表达及相关性研究[J].肿瘤防治研究,2004,31(5):257.

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  [11]Holnthoner W,Pillinger M, Groger M, et al. Fibroblast growth factor-2 includes Lef/Tef-dependent transcription in human endothelial cells[J].J Biol Chem, 2002,277(48):45847-45853.

  [12]Shintani M, Okazaki A, Masude T, et al. Overexpression of CyclinD1 Contributes tomalignant properties of esophageal tumor cells by increasing VEGF poduction and decreasingFas expression[J]. Anticancer Res,2002,22(2A):639-647.

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