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亚砷酸钠和砷酸钠染毒对大鼠二氢尿嘧啶脱氢酶含量的影响

首席医学网      2010年11月23日 10:38:15 Tuesday  
 
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作者:吴军, 吴顺华, 郑玉建     作者单位:(新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室, 新疆乌鲁木齐830011)

【摘要】  目的分析亚砷酸钠和砷酸钠染毒对大鼠二氢尿嘧啶脱氢酶(NAD)含量的影响,寻找不同价态砷代谢的差异,为  进一步阐明砷毒作用机制提供依据。方法70只Wistar大鼠随机分成7组,第1组为正常对照组,饮用去离子水;第2~4组为染毒三价砷(iAS3+)的高、中、低剂量组,分别给予20.0、6.7、2.2 mg/kg体质量亚砷酸钠溶液;第5~7组为染毒五价砷(iAS5+)高、中、低剂量组,分别给予20.0、6.7、2.2 mg/kg体质量砷酸钠溶液。各组大鼠于染毒第3个月末处死,采集血样,并应用酶联免疫分析法(ELISA)测定大鼠血清NAD含量的变化。 结果与对照组比较,砷酸钠高剂量组的NAD含量低于对照组(P<0.05),其余各组与对照组比较差异均无统计学意义。亚砷酸钠各剂量组间比较,高、中剂量组NAD含量均低于低剂量组(P<0.05)。砷酸钠各剂量组间比较,高剂量组的NAD含量均低于中剂量组和低剂量组(P<0.05)。亚砷酸钠和砷酸钠对应剂量组比较,亚砷酸钠高剂量组的NAD含量高于砷酸钠高剂量组(P<0.05),而亚砷酸钠中剂量组的NAD含量低于砷酸钠中剂量组(P<0.05)。结论砷酸钠在高、中剂量染毒条件下分别表现为对NAD活性的抑制和促进,而亚砷酸钠对NAD活性的影响不明显,对NAD活性的影响不同可能与砷酸钠和亚砷酸钠在体内氧化还原代谢过程不同有关。

【关键词】  砷; 二氢尿嘧啶脱氢酶; 酶联免疫分析法

 Abstract: ObjectiveTo explore the mechanism of arsenic toxicology furtherly and seek for thedifference between sodium arsenite and sodium arsenate (different valence state arsenic), we studiedthe influence on content of dihydrouracil dehydrogenas (NAD) in rats treated with sodium arsenite andsodium arsenate. Methods70 Wistar rats were divided randomly into seven groups, 10 rats for eachgroup. Such as control group; sodium arsenite high dose group, middle dose group, low dose groupadministrated with different concentrations of sodium arsenite: 20.0, 6.7, 2.2 mg/kg BW every the day;and sodium arsenate high dose group, middle dose group, low dose group administrated with differentconcentrations of sodium Arsenate: 20.0, 6.7, 2.2 mg As/kg BW every the day. Animals were sacrificedthree months later by cervical dislocation to collect the blood, the content of NAD in blood serum was detected by ELISA. ResultsComparing the content between control group and sodium arsenate highdose group, the difference was statistically significant (P<0.05). Comparing the other groups withcontrol group were not statistically significant. For sodium arsenites, the NAD content in the highdose group and middle dose group were significantly lower than the low dose group (P<0.05). but forsodium arsenates, the NAD content in the high dose group was significantly lower than that in themiddle dose group and low dose group (P<0.05). Comparing the matched doses group of sodium arsenateand sodium arsenite, the NAD content of sodium arsenite in the high dose group was significantlyhigher than sodium arsenate′ (P<0.05), but the NAD content of sodium arsenite in the middle dosegroup was significantly lower than sodium arsenate′ (P<0.05). ConclusionsSodium arsenate with thehigh dose could inhibited NAD activity, but of the middle dose could promote NAD activity. sodiumarsenite did not affect NAD significantly. So, metabolic pathway of sodium arsenate and sodiumarsenite may be different in vivo.

  Key words: arsenic; NAD; ELISA

  砷是一种已知的毒物和人类致癌物,在自然界中广泛存在[1]。机体可通过饮用被高浓度无机砷污染的地下水引起砷中毒,五价砷(iAS5+)是自然界水体中的主要形式,其与无机磷(Pi-)的相似性,导致其可取代Pi而在各类物质与能量代谢中发挥作用[2]。而进入机体的iAS5+也可以被还原成三价砷(iAS3+),再参与机体内的甲基化过程。机体内砷的还原是整个砷代谢的限速过程,并影响体内砷代谢产物的形态和分布,并最终导致砷毒效应的不同。目前,机体内砷相关还原酶的作用机制还不明确,有研究发现二氢尿嘧啶脱氢酶(NAD)参与iAS5+还原为iAS3+的体内过程[3]。本研究拟通过分析亚砷酸钠和砷酸钠染毒对大鼠二氢尿嘧啶脱氢酶(NAD)含量的影响,探讨NAD在砷代谢中的作用,寻找不同价态砷代谢的差异,同时为进一步阐明砷毒作用机制提供依据。

  1材料与方法

  1.1主要仪器与试剂酶标分析仪(上海三科仪器有限公司),隔水式恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司),低温高 速离心机(SIGMA),亚砷酸钠(北京化学试剂三厂),砷酸钠(湖南衡阳凤凰化学工业厂),去离子水(18 ΜΩ),大鼠二氢尿嘧啶脱氢酶酶联免疫分析试剂盒(上海活力生物科技有限公司)。

  1.2方法

  1.2.1动物分组和处理选用Wistar大鼠70只,雌雄各半,体重80~120 g,经1周适应期饲养后随机分成7组,每组10只,雌雄各半,采用喂饲法染毒,采用霍恩氏法[4]测得Wistar大鼠经口半数致死量(LD50),按照卫生毒理学设计要求,以LD50的1/15、1/30和1/60分别确定亚砷酸钠和砷酸钠的高、中、低染毒剂量,第1组为正常对照组,饮用去离子水;第2~4组为染毒三价砷的高、中、低剂量组,分别给予20.0、6.7、2.2 mg/kg体质量亚砷酸钠溶液;第5~7组为染毒五价砷的高、中、低剂量组,分别给予20.0、6.7、2.2 mg/kg体质量砷酸钠溶液。各组大鼠于染毒第3个月末处死,颈动脉采集血液,室温血液自然凝固10~20 min,3 000 r/min离心20 min,收集上清液。

  1.2.2 酶联免疫分析法按照大鼠二氢尿嘧啶脱氢酶酶联免疫分析试剂盒说明,测定大鼠NAD的含量。

  1.3统计学处理所得实验数据采用SPSS13.0软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,进一步多重比较采用LDS-  q检验,检验水准α=0.05。

  2结果

  与对照组比较,砷酸钠高剂量组的NAD含量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)外,其余各组与对照组比较差异均无统计学意义。亚砷酸钠各剂量组间比较,高、中剂量组与NAD含量均低于低剂量组,差异均有统计学意义 (P<0.05)。砷酸钠各剂量组间比较,高剂量组的NAD含量均低于中剂量组和低剂量组(P<0.05)。亚砷酸钠和砷酸钠同一剂量组比较,亚砷酸钠高剂量组的NAD含量高于砷酸钠高剂量组,亚砷酸钠中剂量组的NAD含量低于砷酸钠中剂量组(P<0.05),亚砷酸钠和砷酸钠对应低剂量组间差异无统计学意义,见表1。表1不同价态无机砷染毒各剂量组大鼠NAD的含量比较

  3讨论

  砷中毒的发病机制一直是公共卫生领域的研究重点,但由于砷对机体的作用非常复杂,至今仍没有一种确定的机制学说。目前认为砷的代谢主要涉及氧化还原和甲基化过程,最新的砷代谢模式学说认为[5],进入体内的一部分iAs先由五价砷(iAS5+)还原为三价砷(iAS3+),随后iAS3+与GSH结合生成三谷胱甘肽砷复合物,再进行甲基化代谢。而自然界砷主要以iAS3+和iAS5+ 的化合物形式存在,iAS3+与胱氨酸或半胱氨酸的巯基(-SH)或含-SH的蛋白质紧密结合使其失去活性,从而影响体内代谢,最终产生毒性作用[6]。iAS5+ 除了能被还原成iAS3+,发挥毒性作用外,由于其化学性质和分子结构与磷(Pi)有相似性,可以取代Pi,从而在各类物质与能量代谢中的作用中抑制一些含磷酶活性,因而产生毒性。因此,不同价态砷化合物均可通过其与酶的相互作用,与相关代谢酶的一些亲和力较强的基团结合,从而影响酶的活性,进而导致不同的毒效应。有研究发现二氢尿嘧啶脱氢酶(NAD)能够促进iAS5+还原成iAS3+,而NADH则抑制iAS5+还原成iAS3+[7-8] 。NAD是一种转递电子(更准确来说是氢离子)的辅酶,它出现在细胞很多新陈代谢的反应中,NADH或更准确NADHH是它的还原形式。NAD在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD,使之成为  NADH。而NADHH则会作为氢的载体,在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式,合成三磷酸腺苷(ATP)。例如,参与的糖酵 解:C6H12O6+2NAD++2ADP+2pi→2CH3COCOOH+2NADH+2H++2ATP,而一旦高剂量砷降低了NAD的活力,则会抑制糖酵解过程,进而导致代谢紊乱,从而发挥毒性作用。本研究中,砷酸钠高剂量组的NAD低于对照组,表明iAS5+可能取代了NAD参与糖酵解途径中的Pi,从而抑制了NAD的活性,这与李友[9研究发现iAS5+能抑制一些含磷酶的活性(如ATP酶)类似。而亚砷酸钠高剂量组的NAD与对照组间的差异无统计学意义,这表明高剂量iAS3+对NAD的活性无影响,提示高剂量iAS5+和iAS3+在体内的代谢途径不完全相同。亚砷酸钠各剂量组间比较,高、中剂量组的NAD含量均低于低剂量组(P<0.05),显示较低剂量的iAS3+能促进NAD的活力,这可能是低剂量的iAS3+能被NADH氧化成iAS5+,而此过程NADH脱氢产生了NAD,这与吴军等[10]报道iAS3+能被氧化成iAS5+相一致。亚砷酸钠和砷酸钠同一剂量组比较,亚砷酸钠高剂量组的NAD含量高于砷酸钠高剂量组(P<0.05),这表明高剂量的iAS5+比iAS3+更能抑制还原酶NAD的活性,可能iAS5+剂量达到一定的浓度会取代了NAD中的Pi所致,也可能是iAS5+取代了参与糖酵解的游离态Pi,在糖酵解过程中高剂量的iAS5+消耗了大量的NAD,从而使其含量降低;而亚砷酸钠中剂量组的NAD含量低于砷酸钠中剂量组(P<0.05),表明一定量的iAS5+反而能促进NAD的活力,可能是机体在一定量iAS5+的作用下体内就适应性的增加NAD,促进iAS5+还原成iAS3+。这也进一步表明体内NAD在低剂量染砷条件下主要表现为iAS5+的还原作用,而在高剂量染砷条件下主要表现为iAS5+还原的抑制作用。砷酸钠在高、中剂量染毒条件下分别表现为对NAD活性的抑制和促进,染毒剂量的不同直接影响体内生物有效剂量以及砷代谢产物的形态和体内分布,从而发挥不同的毒效应。而亚砷酸钠对NAD活性的影响不大,两者间的差异可能与砷酸钠和亚砷酸钠在体内氧化还原代谢过程不同有关。

  除了NAD外,体内还有其他的砷还原酶。Engstrom等[11]认为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)能还原所有的五价砷(iAS5+,MMA5+和DMA5+),那是否NAD也能还原其他形态的五价砷呢?iAS5+能取代Pi,是否就能影响所有磷酶的活性呢?另外,不同的还原酶是共同发挥还原作用,还是各自发挥还原作用?以及在什么剂量范围内还原酶将发挥还原作用或抑制还原作用?这些都有待今后进一步研究。砷体内还原过程包括还原酶的研究将为体内代谢机制的研究提供科学详实的基础资料,必将进一步促进砷毒作用机理的探索。

【参考文献】
   [1]Ng JC, Wang J, Shraim AA. Global health problem caused by arsenic from natural sources[J].Chemosphere,2003,52(9):1353-1359.

  [2]Makus JT.Roberr W.Mechanisms involved in metalloid transport and tolerance acquisition[J].Curr Genet,200l,40(4):2-12.

  [3]Thomas DJ, Styblo M, Lin S. The cellular metabolism and systemic toxicity of arsenic[J].Toxicol Appl Pharmacol,2001,176(5):127-144.

  [4]王心如.毒理学实验方法与技术[M].北京:人民卫生出版社,2003:37-39.

  [5]Aposhianh V, Aposhian MM. Arsenic toxicology:five question[J].Chem Res Toxicol, 2006, 19(3):1-15.

  [6]Rosen B. Biochemistry of arsenic detoxification[J].Febs Lett,2002,529(5):86-92.

  [7]Németi B. Glutathione-dependent reduction of arsenate inhuman erythrocytes-a processindependent of purine nucleoside phosphorylas[J].Toxicol Sciences,2004, 82(10):419-428.

  [8]Németi B, Csanaky I, Gregus Z. Arsenate reduction in human erythrocytes and rats testing therole of purine nucleoside phosphorylase[J].Toxicol Sciences,2003,74(9):22-31.

  [9]李友.砷中毒机制研究进展[J].国外医学卫生学分册,2001,28(5):261-314.

  [10]吴军,吴顺华,张杰,等.亚砷酸钠和砷酸钠染毒大鼠尿液砷形态分析[J].中国地方病学杂志, 2010,29(1):23-26.

  [11]Engstrom KS, Broberg K, Concha G, et al. Genetic polymorphisms influencing arsenic metabolismevidence from argentina[J].Environ Health Prspect,2007,115(8):599-605.

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