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消瘤片水提工艺的研究

首席医学网      2010年11月23日 10:44:08 Tuesday  
 
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作者:时欢欢1聂继红2王萍2    作者单位:(新疆医科大学1中医学院中药制剂教研室, 2附属中医医院药学部, 新疆乌鲁木齐830000)

【摘要】  目的优选消瘤片水提工艺。方法以咖啡酸含量、总多糖含量和浸膏得率为指标,采用L9(34)正交设计试验, 对加水倍量、提取时间、提取次数等因素进行考察,以确定最优提取工艺。结果较优工艺为加水14倍量,回流提取3次,每次1 h。结论优选得到的消瘤片水提工艺稳定、可行。

【关键词】  咖啡酸; 总多糖; 单因素实验; 正交试验

 Abstract: ObjectiveTo optimize the extraction process by water on xiao-liu tablets. MethodsTheextraction processes with the content of caffeic acid, total polysaccharides and extractum yield asthe index. The orthogonal test design was used to select the better extraction process. The optimumextraction condition consists of the times of water and extraction time. ResultsThe best condition of  extraction process was 14 times, extracted three times, one hour each. ConclusionThe optimized processis feasible and stable for extraction of caffeic acid.

  Key words: caffeic acid; total polysaccharides; single-factor experiment; orthogonal test design

  消瘤片为新疆医科大学附属中医医院妇科长期临床实践的经验方,其主要功效为活血化瘀、攻坚消瘤。为方便患者使用,本课题组拟采用先进的技术和工艺,将其制成片剂-消瘤片。根据各味药材的主要有效成分和理化性质,对方中蒲公英、茯苓等7味药用水提取,其中咖啡酸为蒲公英的主要有效成分,茯苓等药材主要含有多糖类成分。因此,本研究以咖啡酸、多糖为主要评价指标,采用单因素及正交试验设计优选其水提工艺,现报道如下。

  1仪器与试药

  1.1仪器Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司),Cintra20紫外可见分光光度计(GBC科技仪器有限公司),AL204电子天平、AG135电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司],SK3300LH超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司),Direct QTM5超纯水仪(Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A.)。

  1.2试药咖啡酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110885-200102,供含量测定用),葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110833-200503,供含量测定用),甲醇、乙腈为色谱纯,水为超纯水,试验中其它试剂均为分析纯。茯苓、蒲公英等7味药材由新疆医科大学附属中医医院提供,经检验均符合《中国药典》2010年版一部项下规定。

  2方法与结果

  2.1HPLC法测定咖啡酸含量

  2.1.1色谱条件色谱柱 SYMMETRY C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm),流动相为甲醇-乙腈-0.4%磷酸(22∶2∶76),检测波长323 nm,柱温30℃,流速1.0 ml/min,进样量15 μl。

  2.1.2对照品溶液的制备精密称取咖啡酸对照品3.30 mg,加甲醇适量溶解并定容至 10 ml量瓶中,定容至刻度,摇匀。精密吸取1 ml置10 ml量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀。再精密吸取2 ml置25 ml量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,作为贮备液。

  2.1.3供试品溶液的制备及测定称取该处方各味药材适量,加一定量水回流提取一定时间,待药液冷却至室温后滤过,精密移取4 ml置10 ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,离心,取上清液经微孔滤膜(0.45 μm)过滤后,取15 μl注入高效液相色谱仪测定,供试品溶液高效液相色谱图见图1。图1供试品溶液高效液相色谱图

  2.1.4标准曲线的绘制分别精密吸取贮备液1、2、3、4、5 ml,置于5 ml量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,即得标准溶液。取上述5个标准溶液,分别用微孔滤膜(0.45 μm)过滤后,各取15 μl注入高效液相色谱仪测定。以峰面积积分值(Y)为纵坐标,对照品浓度(X)为横坐标进行回归,得回归方程为:Y =79 202 X-8 895.9,相关系数r=0.999 2。结果显示咖啡酸在0.528~2.64 μg/ml范围内呈良好的线性关系。对照品溶液高效液相色谱图见图2。图2对照品溶液高效液相色谱图

  2.1.5日内、日间精密度试验取同一对照品溶液15 μl在同一天内重复进样5次,并连续测定5 d,计算日内及日间精密度。结果日内精密度RSD=0.78%,日间精密度RSD=1.64%,表明本方法精密度良好。

  2.1.6稳定性试验取同一供试品溶液15 μl,按0、2、4、6、12、24、48 h 间隔进样。测得咖啡酸的峰面积RSD=0.83%,表明供试品溶液在室温下放置48 h内稳定。

  2.1.7重复性试验取供试品6份,按2.1.3项下方法制备供试液,分别精密吸取15 μl进样,测定峰面积。结果RSD=1.73%。表明该方法重复性良好。

  2.1.8加样回收率试验 取2.1.3项下一定量经测定已知含量的供试品溶液,加入不同量的咖啡酸对照品溶液,制备成 高、中、低浓度的各3份样品,按2.1.1项下色谱条件进行含量测定。结果平均加样回收率为100.34%,RSD=1.17%(n=9)。

  2.1.9阴性对照试验精密称取处方中水提部分除蒲公英外的6味药材,按照2.1.3项下的方法制备缺蒲公英的阴性对照 溶液。用高效液相色谱法测定,进样量15 μl。结果表明,消瘤片处方中水提部分中其余药材对咖啡酸的含量测定无干扰。阴性对照溶液高效液相色谱图见图3。图3阴性对照溶液高效液相色谱图

  2.2紫外可见分光光度法测定总多糖含量

  2.2.1对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品11.32 mg至10 ml量瓶中,加水定容至刻度,摇 匀。再取2.5 ml置25 ml量瓶中,加水定容至刻度摇匀,得浓度为 0.113 2 mg/ml 的葡萄糖标准品储备液。

  2.2.2供试品溶液的制备方法称取处方中水提药材,加适量水加热回流一定时间,精密移取滤液1 ml置100 ml量瓶中,定容至刻度,即得。

  2.2.3最大吸收波长的测定精密吸取葡萄糖标准品储备液和2.2.2项下样品溶液各0.4 ml于10 ml具塞试管中,加水至2  ml,分别加入1 ml 5%苯酚溶液和5 ml浓硫酸,迅速摇匀,放置5 min,置沸水浴中加热20 min,取出迅速冷却至室温。另取2.0 ml蒸馏水同前加入试剂操作,作空白对照,在400~800 nm波长处扫描。结果显示葡萄糖对照品溶液和供试品溶液经显色后均在487 nm处有最大吸收。

  2.2.4标准曲线的制备精密吸取葡萄糖标准品储备液各0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml于10 ml具塞试管中,同2.2.3项下操作,测定吸收值。以吸光度(Y)对葡萄糖浓度(X)进行回归分析,得标准曲线:Y=0.011 1 X-0.015,r=0.9955,表明葡萄糖浓度在22.64~67.92 μg/ml范围内呈现良好的线形关系。

  2.2.5精密度试验同时精密吸取2.2.2项下供试品溶液2 ml、标准品储备液 0.4 ml,照2.2.3项下操作,连续测定5次吸收值。结果供试品及标准品RSD分别为0.11%、0.16%,表明本方法精密度良好。

  2.2.6稳定性试验精密吸取2.2.2项下供试品溶液2 ml,照2.2.3项下操作,显色后放置30、45、60、85、100、125、150、180、240 min时分别测定吸光度。对4 h内显色稳定性进行了考察。测定结果RSD=1.98%,表明供试品溶液显色后在4 h内吸光度稳定。

  2.2.7重复性试验精密吸取2.2.2项下供试品溶液2 ml,共6份,测定吸收值。结果RSD=2.49%,表明该法重复性良好。

  2.2.8加样回收率试验取2.2.2项下经测定已知含量的供试品溶液0.3 ml,加入不同量的葡萄糖标准品溶液,制备成高、中、低浓度的各3份样品,按2.2.3项下操作,测定吸光度。结果平均加样回收率为100.44%,RSD=2.61%(n=9)。

  2.3提取工艺筛选[1-3]

  2.3.1因素水平的确定以咖啡酸含量、总多糖含量及水提液的浸膏得率为考察指标,采用综合评分法,权重系数分别 为50、30、20,满分为100。

  综合评分=(咖啡酸含量/最大咖啡酸含量)×50+(多糖含量/ 最大多糖含量)×30+(最小浸膏得率/浸膏得率)×20根据单因素实验结果,选择L9(34)正交表,进行正交试验设计,具体见表1。表1因素水平表

  2.3.2正交试验精密称取消瘤片处方中用水提取的药材,按以下正交试验表安排实验(每个实验同时做3个平行样),分别测定咖啡酸含量、总多糖含量、浸膏得率,并进行综合评分。直观分析结果可知,RC>RB>RA,即对提取影响大小顺序为C>B>A,最佳提取工艺为A3B3C3,见表2。表2正交试验结果

  2.3.3方差分析结果 对正交试验结果进行方差分析,结果表明,提取次数对该方的提取效果有显著性影响(P<0.05),提取时间和加水倍数对提取效果均无显著性影响。结合工业大生产,从节约成本的角度考虑,确定较优提取工艺为A1B1C3,即14倍量水,回流提取3次,每次1 h,见表3。表3方差分析

  2.3.4验证试验精密称取处方中用水提取的药材3份,按A1B1C3回流提取得样品溶液,分别测定咖啡酸含量、总多糖含  量、浸膏得率,并计算综合评分(表4)。结果表明,本试验确定的消瘤片水提工艺稳定、可行、合理。表4正交试验验证结果

  3结论

  3.1测定咖啡酸含量时,在确定供试品溶液的HPLC色谱条件时,考察了药典方法[4]、甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水等,结果样品峰与杂质峰未能有效分离。经反复试验,在流动相为甲醇-乙腈-0.4%磷酸(22∶2∶76)时,咖啡酸峰与其他组分色谱峰能较好地分离,空白对照亦无干扰,且峰形较好。经方法学研究结果表明,本方法简便、准确、重复性好,可作为本方水提工艺中咖啡酸的含量测定用。

  3.2咖啡酸、多糖为本方的主要有效成分,根据它们对疗效的影响程度,确定咖啡酸权重系数为50,多糖权重系数为 30,并确定浸膏得率权重系数为20,满分为100。

  3.3本试验采用单因素试验及正交设计试验,经验证试验最终确定14倍量水,回流提取3次,每次1 h的方法为最优工  艺。优选得到的消瘤片水提工艺简易、稳定、可行,为工业化生产提供了一定的依据。

【参考文献】
   [1]谭红胜,夏兴华,楚生辉.正交试验法优选蒲公英水提工艺[J].中药材,2004,27(3):211-212.

  [2]钟世红,卫莹芳,古锐,等.苯酚-硫酸比色法测定红毛五加皮多糖的含量[J].时珍国医国药,2010,21(2):266-267.

  [3]张西如,姜建国.正交试验研究蒲公英注射液的提取工艺[J].中成药,2007,29(7):1075-1077.

  [4]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:化学工业出版社,2010:331.

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