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驱虫斑鸠菊不同提取部位对小鼠B16细胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影响

首席医学网      2010年11月23日 10:39:55 Tuesday  
 
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作者:姚莉1作李茜1, 尚靖2     作者单位:(1新疆医科大学附属中医医院药学部, 新疆乌鲁木齐830000; 2江苏南京市中国药科大学新药筛选中心, 南京210038)

【摘要】  目的观察驱虫斑鸠菊不同提取部位对体外培养的小鼠B16细胞黑素合成和酪氨酸酶活性的影响。方法由驱虫斑鸠菊得到3种不同部位提取物,分别为母液(Q1)、乙酸乙酯提取物(Q2)及萃取后物质(Q3)。以体外培养的小鼠B16黑素瘤细胞为模型,以3个色素合成途径中的关键点为多靶点评价体系,其中采用MTT法测定提取物对B16小鼠黑素瘤细胞增殖的影响,采用L-DOPA氧化法测定对酪氨酸酶活性的影响,采用NaOH裂解法检测黑素含量。结果3种提取部位对B16细胞都有一定的增殖作用,其中Q1、Q2促进增殖作用明显(P<0.01),Q3有轻微的促进增殖的作用。Q1、Q3对酪氨酸酶有不同程度的激活作用并促进黑素的合成,其中Q3 在20~80 μg/ml 范围内促进B16细胞黑素合成作用明显(P<0.05或P<0.01),且Q3以浓度依赖方式上调酪氨酸活性。结论驱虫斑鸠菊残留的水溶性部分是稳定的调节B16细胞黑素合成的活性部位。

【关键词】  黑素合成; 小鼠B16细胞; 驱虫斑鸠菊; 活性部位

 Abstract: ObjectiveTo investigate the regulation of melanogenesis and tyrosinase activity in theresponse of B16 murine melanoma cells to different fraction from Vernonia Anthelmintica Willd.MethodsThe samples were prepared by solvent extraction, three extracts were gotten from VernoniaAnthelmintica Willd, mother liquid (Q1), ethylacetate extract (Q2), water extract (Q3). Theculture B16 murine melanoma cells was used as a model, three critical points in the route ofmelanogenesis as multiple target appraisal system. MTT was used to study the proliferation, thetyrosinase activity was detected by L-DOPA-Oxidation, the melanin was measured by NaOH-assay.ResultsAll of three fraction increased cell proliferation, Q1 and Q2 significantly increased cellproliferation (P<0.01), while the function of Q3 was slight. The tyrosinase activity tests showedthat Q1 and Q3 stimulated the activity and increase melanin content, 20~80 μg/ml Q3 would obviouslyincrease melanin content (P<0.05,P<0.01), and upraise the activity of tyrosinase in a dose-dependent manner. ConclusionActive fraction mainly exists on large polarity,while water extract is astable active fraction.

  Key words: melanogenesis; B16 murine cell; Vernonia Anthelmintica Willd; active fraction

  驱虫斑鸠菊(Vernonia Anthelmintica Willd)系菊科(Compositae)一年生草本植物, 为维吾尔民间习用药材。其药用部位为驱虫斑鸠菊植物的成熟果实, 具有清除异常粘液质、驱虫、消肿、散寒止痛的作用, 用于治疗湿寒性胃痛、肝病、白癜风等[1]。马慧军等[2]报道总黄酮是治疗白癜风的主要活性物质,但特点和作用机制不清楚。本研究对驱虫斑鸠菊植物成熟果实的3种不同部位提取物进行药效学实验研究,旨在观察驱虫斑鸠菊不同提取部位对小鼠B16细胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影响,现报道如下。

  1材料与方法

  1.1试剂、仪器及细胞RPMI1640 培养基(美国GIBCO公司),新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),L- DOPA (左旋多巴,美国Sigma 公司), MTT ( 四甲基偶氮唑蓝,上海华舜生物有限公司),胰蛋白酶(美国Sigma 公司),DMSO(二甲基亚砜,Sigma 公司),8-MOP(8-甲氧补骨酯素,江苏溧阳市制药厂),小鼠B16 黑素瘤细胞( 中国科学院上海细胞库),Safire2型微孔板酶联免疫检测仪(瑞士TECAN公司),IX71倒置荧光相差显微镜(日本Olympus公司),超净工作台(苏州艾可林净化设备有限公司),BB 16型二氧化碳培养箱(德国Hearous公司)。

  1.2药材提取浸膏及配制驱虫斑鸠菊种子300 g,水煎煮3次,合并煎煮液并浓缩成浸膏,得到的浸膏经石油醚脱脂后为母液(Q1),母液采用乙酸乙脂萃取,其萃取物为Q2(0.5 g)及萃取后物质Q3(21 g)。8-MOP为白色结晶,是一种呋喃香豆素类光敏物,内服或外用8-MOP 结合长波紫外线照射( PUVA) 能使白癜风色素减退皮损复色,是临床使用最多、疗效得到公认的一种治疗白癜风的方法,为本实验的阳性对照。将Q1、Q2、Q3、8-MOP先用DMSO溶解,再用RPMI 1640稀释成贮存液,避光保存在-20℃,临用前用新鲜培养基调至终浓度。

  1.3方法

  1.3.1MTT法测细胞增殖率[3]将传代细胞的浓度调节至2.5×104个/ml,加入96孔板,每孔0.1 ml后,用含不同浓度处理因素的新鲜培养液换液1次,置37℃、5% CO2条件下继续培养48 h,每一处理因素设立3个复孔。结束前4 h加入MTT溶液20 μl /孔,4 h后弃上清液,每孔加入150 μl DMSO,充分振荡,置酶标仪测A570。增殖率用每个细胞加药处理组A570 值占空白对照组A570值的百分率表示,每一处理因素重复测定3次。

  1.3.2L-DOPA氧化法测定酪氨酸酶活性由张汝芝等[4]的方法经过调整,根据实验设计要求和培养瓶规格选定细胞初始接种浓度为5×105个/瓶。细胞接种24 h后,用添加药物的新鲜培养基换液1次,继续孵育48 h。收获大约1×106个细胞,离心后PBS洗涤2次,加入20 mmol/L Tris-0.1%Trionx-100 1 ml,放入4℃冰箱裂解1 h,1 000 r/min离心5min,取上清夜加入96孔板,每孔100 μl,再加入0.1% L-DOPA反应液(PBS,pH=6.8)100 μl,振摇5 min后放入37℃培养箱孵育25 min。于分光光度计上测A475 值。酪氨酸酶激活率用每个细胞加药处理组A475 值/细胞数占空白对照组A475值/细胞数的百分率来表示。每一处理因素重复测定3次。

  1.3.3黑素含量的测定[4-5]选定细胞初始接种浓度为5×105个/瓶。细胞接种24 h后,用添加药物的新鲜培养基换液1次,继续孵育72 h。收获大约1×107个细胞,离心后PBS洗涤2次,加入含1 mol/L的NaOH(含10%DMSO)吹打数次,放入80℃水浴30 min,使黑素颗粒完全溶解,1 000 r/min离心5 min,取上清夜加入96孔板,每孔100 μl,于分光光度计测A475 值。黑素含量用每个细胞加药处理组A475值/细胞数占空白对照组A475值/细胞数的百分率来表示。每一处理因素重复测定3次。

  1.4统计学处理使用SPSS16.0软件进行统计学分析,所测数据以均数±标准差(±s)表示,配对t检验,检验水准α=0.05。

  2结果

  2.13种提取物对B16细胞形态的影响在倒置显微镜下观察,传代生长的B16细胞主要为双极,偶见三极生长的细胞。经  驱虫斑鸠菊作用后,可以发现B16黑素细胞树突增多延长,树突边缘胞浆内可见较多细小的棕黑色颗粒,见图1。图1驱虫斑鸠菊3个提取部位作用后B16细胞形态 (×200) A: 空白组; B: Q1(10 μg/ml); C: Q2(10 μg/ml); D: Q3(10 μg/ml)

  2.2不同提取物对B16细胞增殖的影响在实验浓度范围内,同空白对照比较,Q1、Q2均能刺激细胞增殖,Q1在5~20 μ  g/ml作用最明显(P<0.05),Q2在10 μg/ml作用最强(P<0.01),Q3在(1.25~40 μg/ml)浓度范围有轻度刺激细胞增殖的作用。对B16细胞增殖作用Q2>Q1>Q3,见表1。随药物极性的增大,部位达到最大增殖作用的浓度增高,最高增殖率降低,初步预测对细胞有增殖作用的活性物质向集中于极性低的部位。阳性对照药物对B16细胞增殖有轻微促进作用。

  2.3不同提取物对B16细胞内酪氨酸酶活性和黑素合成的影响 与空白对照组比较,在实验浓度范围内,Q1和Q3均能明  显上调B16细胞内酪氨酸酶活(P<0.05或P<0.01),并促进黑素合成。在实验浓度范围内Q2有一定抑制酪氨酸酶活性的作用,但对黑素含量无明显影响(P>0.05),Q3在20~80 μg/ml浓度范围促进B16细胞黑素合成作用明显(P<0.05或P<0.01),80 μg/ml的Q3提取物促进黑素合成和酪氨酸酶活性的作用与40 μg/ml的阳性对照8-MOP相当(P>0.05)。且Q3以浓度依赖方式上调酪氨酸活性,进一步说明酪氨酸酶活性直接与黑素含量有关。对B16细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的作用,Q3>Q1>Q2,见表2 。表1Q1、Q2、Q3、8-MOP对B16细胞增殖率的影响表23种提取物对B16细胞内酪氨酸酶活性和黑素含量的影响

  3讨论

  细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素含量是3种筛选治疗色素障碍性疾病如白癜风药物的常用指标,其中酪氨酸酶是色素 疾病病因病理与药物干预色素代谢的研究焦点。本实验在前期采用了A375(人恶性黑素瘤细胞)作为模型,检测药物的作用,发现Q1、Q2、Q3均有一定促进A375细胞增殖的作用,但对酪氨酸酶和黑素含量的作用不明显。而邓瑞春等[6]报道驱虫斑鸠菊注射液能促进A375细胞增殖,上调酪氨酸酶活性和黑素含量,与本实验前期结果不大一致。Eberle等 [7]报道A375是一种酪氨酸酶和黑素表达量很低的细胞系,因此在实验中很难检测到酪氨酸酶和黑素含量,初步判定并不适用于作为调节黑素代谢药物的筛选模型。B16小鼠黑素瘤细胞是一种高度黑素化的黑素瘤细胞株,国际上常用于黑素合成的相关研究,因此本实验以体外培养的B16鼠黑素瘤细胞为模型,从三方面来分析驱虫斑鸠菊的提取物,发现不同的提取方式得到的提取物其药效有一定的差异:驱虫斑鸠菊作用72 h后,黑素细胞树突增多延长,树突边缘胞浆内可见较多细小的棕黑色颗粒,提示驱虫斑鸠菊可诱导黑素小体成熟化和向树突边缘转移。在实验浓度范围内(20~80 μg/ml),驱虫斑鸠菊Q3提取物对体外培养的的B16细胞黑素合成作用明显(P<0.05或P<0.01),且以浓度依赖方式上调酪氨酸活性,该作用在72 h达到高峰。80 μg/ml的Q3提取物促进黑素合成和酪氨酸酶活性的作用与40 μg/ml的阳性对照8-MOP相当。初步表明调节B16细胞黑素合成的活性部位主要集中于极性大的溶剂中,即驱虫斑鸠菊残留的水溶性部分。驱虫斑鸠菊提取物Q1、Q2均能刺激细胞增殖,Q1在5~20 μg/ml作用最明显(P<0.05),Q2在10 μg/ml作用最强(P<0.01),Q3在(1.25~40 μg/ml)浓度范围有轻度刺激细胞增殖的作用,而高浓度的Q1、Q2提取物(>100 μg/ml)对细胞生长有一定的抑制作用。提示在实验中应根据IC50调整驱虫斑鸠菊的量,避免高浓度形成的药物毒性作用。黑素细胞合成黑素是一种多步骤、多酶参与的复杂过程,酪氨酸酶是黑素合成中最为关键的一种限速酶,TRP1和TRP2同属于酪氨酸酶基因超级家族成员,二者催化黑素合成的后续步骤,在黑素细胞内它们与酪氨酸酶一起以多酶复合体形式存在,并对该复合体起稳定作用。雷铁池[8]报道一些能上调黑素合成作用的物质都与酪氨酸酶的表达有一定联系,在此基础上分析活性成分的共同结构与对酪氨酸酶表达的影响有待进一步的研究。

【参考文献】
   [1]刘勇民.维吾尔药志(上册)[M].乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社,1999:283-286.

  [2]马慧军,訾绍霞,李铀,等.驱虫斑鸠菊黄酮促人表皮黑素细胞黑素合成及其机制的研究[J].中国美容医学,  2008,17(4):524-526.

  [3]任玉珊,韩钰,曹春雨,等.多胺类似物BENS对黑素瘤B16-F1细胞生长的影响[J].肿瘤,2009,29(3):206-209.

  [4]张汝芝,朱文元,谢芳,等. 橙皮苷对UVB照射后的B16和HaCaT细胞的作用[J].临床皮肤科杂志,2008,37(3):146-149.

  [5]努尔买买提·艾买提,哈木拉提·吾甫尔,吐尔逊·吾甫尔.异常黏液质成熟剂对B16黑色素瘤细胞的增殖、酪氨酸酶活性、黑色素的合成的影响[J].中成药,2007,29(12):1824-1826.

  [6]邓瑞春,周勇,章金刚.驱虫斑鸠菊对人黑素瘤细胞增殖酪氨酸酶及黑素生成影响的研究[J].生物技术通讯.2002,13(2):135-137.

  [7]Eberle J, Wagner M, Macneil S.Human melanoma cell lines show little relationshiop bewteenexpression of pigmentation genes and pigmentary behaviour in vitro[J].Pigment Cell Res,1998,11:134-142.

  [8]雷铁池.酪氨酸酶基因家族与皮肤黑素合成[J].国外医学皮肤性病学分册,1998,24(2):81-85.

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