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RP-HPLC法测定新疆不同产地药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量

首席医学网      2010年11月23日 10:40:47 Tuesday  
 
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作者:阿合买提江·吐尔逊1 赵文惠2, 孙莲3, 王岩1, 张煊1, 古丽江·马合苏提汗4    作者单位:(新疆医科大学药学院1分析/药分教研室, 2分析测试中心, 3化学教研室, 4药学2006-2班, 新疆乌鲁木齐830011)

【摘要】  目的考察新疆不同产地、不同采摘时间药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量变化。方法采用反相高效液相色谱法  (RP-HPLC),以大连依利特 Hypersil ODS(150 mm×4.6 mm,5 μm)为色谱柱,进样量20 μl,流动相为乙腈(A)-水(B)-0.2%磷酸溶液(pH=4.8)(C),梯度洗脱[0 min,A-C(18∶82);4 min,A-C(21∶79);10 min,A-C(8∶92)],流速1.0 ml/min,检测波长为358 nm,柱温为25℃。结果不同产地、不同采摘时间的药桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量均有一定的差异,喀什地区、5~6月份二者含量较高。结论药桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量与产地和采摘季节等有关,尤其以季节的影响大。

【关键词】  药桑叶; 芦丁; 异槲皮苷; 反相高相液相色谱法

 Ahemaitijiang·Tuerxun, ZHAO Wen-hui, SUN Lian, et al(Pharmacy College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)Abstract: ObjectiveTo investigate the content difference of rutin and isoquercitrin in drug mulberryleaves from different areas in Xinjiang. MethodsReversed phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC) with Yilite Hypersil ODS (150 mm×4.6 mm, 5 μm) chromatographic column was used. Thesample size was 20 μl, the mobile phase was acetonitrile (A)-water (B)-0.2 % phosphoric acid (C)with gradient elution [0 min, A-C (18∶82); 4 min, A-C (21∶79); 10 min, A-C (8∶92)]. The flow ratewas 1.0 ml/min,the detection wavelength was at 358 nm, and the column temperature was 25℃.ResultsThe contents of two components changed at some degree in drug mulberry leaves from differentplant sites,while the contents varied obviously among drug mulberry leaves from different collection time and different varieties. ConclusionThe contents of the two components are influenced by collectedtime and plant site, espacially by collected time. Both rutin content and isoguercitrin content arehigher in the mulberry leaves picked in kashi, in June and July.

  Key words: drug mulberry leaves; rutin; isoquercitrin; RP-HPLC

  桑叶为桑科(Moraceae)桑属(Morus L.)植物的叶,中国大部分地区均有栽培生产。桑叶入药首见于《神农本草经》,列为中品。用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花,收载于2005版《中国药典》(一部)[1]。现代药理研究表明,桑叶具有增强免疫、促进造血细胞生长、降糖降脂[2-3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、抗诱变等多种活性。近年来对桑叶化学成分的研究表明,桑叶中含有黄酮类、生物碱类、苯丙素类、有机酸类、甾体及三萜类等多种化合物[6]。黄酮类化合物是桑叶的重要活性成分之一[7-8]。新疆药桑是维吾尔族重要的民间药材,维吾尔语称沙土提,药桑椹1988年被国家卫生部列为首批药食同植物,被医学界誉为“民间圣果”和“世纪的最佳保健果”[9]。按新疆习惯命名法,新疆桑树分为黑桑、白桑、粉桑、公桑和药桑5大类型[10],其中新疆药桑在桑树植物分类学上属于半载培半野生的的黑桑种,体细胞染色体倍数性为自然22倍体(2n=22x=308),是自然界极为罕见的稀贵桑树半栽培半野生资源,也是我国唯一的黑桑种,栽培适应地只限于新疆,主要分布在新疆阿克苏地区、巴音郭楞蒙古自治州和克孜勒苏柯尔克孜自治州[11]。新疆药桑是营养价值很高的天然绿色食品。目前生产上开发最多的为药桑桑叶茶。药桑中的黄酮类物质主要成分包括芦丁、异槲皮苷、槲皮苷、黄芪苷等,其中以芦丁和异槲皮苷含量最高。这些黄酮类物质具有降血压、抗衰老、防癌、抑制血清脂质增加和抑制动脉粥样硬化形成的作用,并能改善肝功能,软化毛细血管,改善血液循环系统,有效防止脑中风、脑血栓、脑溢血等心脑血管疾病,还有抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂、强心等作用以及祛风清热、凉血明目、利尿等生理作用[12]。现行药典采用HPLC法测定桑叶中芦丁含量,孟磊等[13]报道对新疆桑叶总黄酮含量进行测定,但对新疆药桑中芦丁和异槲皮苷的测定尚未见报道。本文建立了同时测定新疆药桑叶中芦丁、异槲皮苷含量的RP-HPLC方法,并考察新疆不同产地、不同采摘时间药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量变化,以便为新疆药桑叶的质量控制和合理开发提供参考。

  1仪器与试剂

  Waters高效液相色谱仪2690-2487,乙腈、甲醇(色谱醇、分析纯);0.2%磷酸溶液;芦丁(中国药品生物制定检定所)和异槲皮苷(天津一方科技有限公司)的标准品,其余试剂为分析纯。

  2方法

  2.1色谱条件色谱柱:大连依利特 Hypersil ODS(4.6 mm×150 mm,5 μm),流速为1.0 ml/min,检测波长为358nm,柱温25℃;进样量20 μl,流动相A:乙腈;B:水;C:0.2%磷酸溶液(pH = 4.8);梯度洗脱程序:0 min, A-C (18∶82);4 min,A-C (21∶79);10 min,A-C (8∶92),结果见图1。图1混合对照品(A)及桑叶样品(B)色谱图(1:芦丁; 2: 异槲皮苷)

  2.2标准品溶液的制备精密称量芦丁1.7 mg、异槲皮苷1.2 mg,置入10 ml容量瓶,加色谱醇甲醇溶解并稀释至刻度,得到混合对照品溶液浓度(芦丁170 μg/ml、异槲皮苷120 μg/ml)。

  2.3供试品溶液的制备干燥桑叶,过40目筛,称取1 g,用分析醇甲醇为溶剂,固液比为1∶30,进行加热回流提取,提取2 h过滤,残渣再加入30 ml甲醇提取2 h,过滤,合并滤液定容置50 ml量瓶中,得供试品溶液。

  2.4标准曲线绘制芦丁、异槲皮苷对照品适量,用色谱纯甲醇配成含芦丁170 μg/ml 、异槲皮苷120 μg/ml的混合溶液,精密量取混合对照品溶液0.15、0.25、0.50、1.00、2.00、2.50、3.25 ml,分别置于5 ml容量瓶中,加色谱纯甲醇至刻度,摇匀,即得不同浓度的混合对照品溶液。分别进样20 μl,以峰面积(Y)为纵坐标,对照品溶液的浓度(X)为横坐标,绘制标准曲线,求得芦丁和异槲皮苷的回归方程分别为:芦丁: Y=24 925X-30 950, r=0.999 9; 异槲皮苷: Y= 35 517X-36 804, r=0.999 9。结果表明,芦丁和异槲皮苷2种黄酮成分的浓度分别在5.1~110.5μg/ml、3.6~78.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

  2.5稳定性试验取同一样品溶液,分别于0、1、2、4、8、24 h进样,测峰面积,计算得芦丁和异槲皮苷RSD值分别为 1.9%、2.0%,说明样品溶液在24 h内基本稳定。

  2.6精密度试验取对照品2 ml置10 ml容量瓶中,定容。连续进样5次,测得峰面积,计算芦丁、异槲皮苷峰面积的RSD  分别为1.8%、1.5%,说明该仪器精密度良好,结果见表1。

  2.7重复性实验取新疆药桑叶粉末(40目)制备供试品溶液,平行操作5次,测得芦丁和异槲皮苷含量的RSD值分别为  1.5%、1.3%,表明该方法重复性良好。表1精密度试验结果

  2.8加样回收率试验加样回收率试验精密称取已测知含量的药桑叶样品(喀什地区莎车县2009年6月)3份,每份精密量  取5 ml置10 ml量瓶中,每份分别精密加人混合对照品溶液(芦丁浓度:1.9 mg/ml ,异槲皮苷浓度:0.9 mg/ml)1、1.5、2 ml,用流动相(乙腈∶0.2%磷酸溶液=20∶80)定容至刻度,测得低、中、高3个浓度的平均回收率(n=3),每种浓度连续进样3次,芦丁的平均回收率分别为103.7%、103.7%、99.3%;RSD为0.2%、0.5%、0.2%,总平均回收率为102.2%,平均RSD值为0.3%;异槲皮苷分别为98.9%、95.7%、97.6%; RSD为0.2%、0.3%、0.06%,总平均回收率为97.4%,平均RSD值为0.19%,结果见表2。表2回收率测定结果

  3样品测定

  将不同产地、不同采摘时间的药桑叶样品按制备2.3样品溶液,按2.1项的色谱条件进样,测得峰面积,计算芦丁和异  槲皮苷的含量。

  3.1不同产地的药桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量喀什地区药桑中芦丁和异槲皮苷的含量较大(表3)。表3不同产地药桑中芦丁、异槲皮苷的含量

  3.2不同采摘时间药桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量不同采摘时间桑叶中的芦丁和异槲皮苷含量均有差异,5月份和6月份 桑叶中的芦丁和异槲皮苷含量高,7、8月份含量降低,这可能是由于5、6月份药桑叶为新鲜嫩叶,所以含量高于7、8月份(表4)。表4不同采摘季节桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量

  4讨论

  4.1样品溶液制备方法的考察本实验在参考文献的同时考察了不同浓度乙醇(50%、70%、80% )、甲醇为提取溶剂,不 同浓度乙醇和甲醇的提取结果基本一致,但不同浓度的乙醇提取的样品杂质峰也较多,因此选用甲醇为溶剂。提取方法考察了热回流、超声提取,发现回流提取效率高。比较回流提取不同提取次数及每次提取时间 (2 h 2次、2 h 3次、4 h 1次),再比较提取溶剂用量(30 ml、50 ml),提取率基本一致,因此选择30 ml,甲醇回流提取 2 h 2次。

  4.2检测波长的选择采用紫外检测器,对标准品进行最大波长扫描,结果显示芦丁和异槲皮苷在256、358 nm处有最大 吸收波长,经过高效液相进样,发现在256 nm杂质峰很多,同时也参考了大量的文献,选择358 nm为测定波长。

  4.3流动相的选择本实验通过大量阅读文献,对以下2种流动相方法做了考察:甲醇∶水和乙腈∶0.2%磷酸缓冲盐,2  种分别作了梯度和等度条件的考察,结果表明,使用甲醇时芦丁和异槲皮苷对照品未能完全分离,使用水和乙腈时虽然芦丁和异槲皮苷对照品达到基线分离,但峰形不好,加入0.2%磷酸缓冲盐后峰形得到改善,改用乙腈∶0.2%磷酸缓冲盐作为流动相梯度洗脱,由图1可看出,对照品以及样品各组分均能较好分离。因此选择了乙腈∶0.2%磷酸缓冲盐作为流动相梯度洗脱。

  4.4未知物分析从样品图(图1B)可知,除已知的芦丁和异槲皮苷外,至少还有1种含量较高的物质(保留时间为4、4.5  min),有待进一步研究确定。芦丁和异槲皮苷是药桑叶中主要的黄酮类成分,可以作为药桑叶黄酮测定的指标。本实验采用RP-HPLC法,采用梯度洗脱方式,在10 min内同时测定了不同产地、不同季节药桑叶中芦丁和异槲皮苷的含量,结果表明不同产地药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量有一定的差异,可能是因为地理环境的不同,天气、温度变化的不同导致这些差异。不同季节的药桑叶中二者的含量也有明显的差异,说明采摘时间越早桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量越高,并且随着季节的变化含量有明显的降低。药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量有助于进一步研究其效应成分及质量的有效控制。由于药桑叶中芦丁、异槲皮苷的含量受不同产地、不同季节等多种因素的影响,作用因素较为复杂,有待进一步的考察。

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