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“三阶段法”分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞

首席医学网      2010年11月23日 10:39:07 Tuesday  
 
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作者:许永华1, 许琴1, 李建瑛1, 是文辉1, 李佳佳1, 卢开伯1,邢彦超2, 于良宽3, 龙志新4    作者单位:(1兰州军区乌鲁木齐总医院实验动物科, 2输血科, 3妇产科; 4新疆出入境检验检疫局, 新疆乌鲁木齐830000)

【摘要】  目的探讨运用“三阶段法”分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞的效果。方法取人脐带血4份,经过3个阶段(去除红细胞阶段、短暂培养阶段、持续培养阶段),以完全低糖DMEM(含20%胎牛血清)为培养基,纯化分离人脐血间充质干细胞。传代至第3代通过流式细胞仪和间充质干细胞诱导分化为成骨细胞进行鉴定。结果4份人脐血中3份分离出间充质干细胞。分离培养的细胞经流式细胞仪检测不表达造血细胞的抗原(CD34-),表达间充质干细胞的抗原(CD29+、 CD44+ 、 CD105+),并能向成骨细胞方向分化。结论“三阶段法”能够简便、有效地从人脐血中分离出间充质干细胞。

【关键词】  人脐静脉血; 间充质干细胞; 体外培养

 Abstract: ObiectiveTo culture and identify human umbilical cord blood MSCs (mesenchymal stem cells)using three phase approach. MethodsThrough three phases (removal ofred blood cell, briefly culturing and phase of lasting culturing) to separate MSCs from 4 human umbilical cord blood samples. Culturemedium with low glucose DMEM was supplemented with 20% fetal calf  serum. Isolated MSCs were passaged to the third generation for identifying. ResultsThree groups ofMSCs were separated from 4 groups of samples. By flow cytometry analysising , cells expressed MSCssurface markers of CD29, CD44 and CD105 positively and CD34 negatively. The result of thedifferentiation of osteoblast-like cells derived from human umbilical cord blood was positive also. ConclusionWe can easily and effectively separate MSCs from human umbilical Cord Blood by three phasesapproach.

  Key words: human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; in vitro culture

  人脐血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)具有良好的多向分化潜能,在适当的诱导条件下可以多向分化为间质谱系内的各种细胞[1-2],跨系分化为外胚层的神经细胞[3]、内胚层的肝细胞[4]。作为一类潜在的组织工程种子细胞,如何纯化分离出能够传代的间充质干细胞是非常关键的一步。目前常使用的纯化方法有流式细胞仪分离纯化法、免疫磁珠分离法和密度梯度离心法等[5]。但是利用流式细胞仪法、免疫磁珠法分离人脐血间充质干细胞,不但成本高,而且难以培养成活;利用密度梯度离心法分离培养的脐血有核细胞,虽可见到生长的细胞,却难以进一步传代扩增。本实验采用“三阶段法”对人脐血间充质干细胞进行体外纯化分离,培养出了UCB-MSCs,并进行了传代和鉴定。

  1材料与方法

  1.1设备CO2孵育箱(Forma Scientific),超净台(苏州),倒置显微镜(Olympus CKX41SF),数码相机(Olympus),离心机(科大创新 HC-3018R),酶标仪(BIORAD 550)。

  1.2试剂低糖DMEM(GIBCO),胎牛血清(HYCLONE),明胶(Sigma),谷胺酰胺(BIOSHARP),抗生素(国产),茜素红S(  国产),地塞米松(Sigma),β-甘油磷酸钠(Sigma),维生素C(Amresco)。

  1.3液体配制方法

  1.3.1完全培养基800 ml低糖DMEM+200 ml胎牛血清+10 ml 200 mmol/L谷胺酰胺+10 IU/ml青霉素+10 IU/ml链霉素。

  1.3.2成骨诱导分化液地塞米松(1 mg/100 ml)+β-甘油磷酸钠(150 mg/100 ml)+维生素C(5 mg/100 ml)

  1.3.3茜素红S染液2 g茜素红S+100 ml纯水,完全溶解后加入10%胺水10滴,调pH值至4.2。

  1.4血样采集方法使用250 ml采血袋采集38~42周孕龄的健康孕妇脐静脉血80~100 ml。

  1.5培养方法第一阶段(去除红细胞):现配制3%明胶,高压灭菌,冷却后,25 ml/支加入50 ml离心管备用。无菌取  脐静脉血25 ml沿离心管管壁加入与明胶混合。37℃、5%CO2孵育30 min。取上清,300 g离心10 min。Hank′s液洗涤2次(1 000 r/min,离心5 min),去上清,加入完全培养基备用。第二阶段(短暂培养):备用细胞悬液,接种培养瓶中。培养15 h,晃动培养瓶,取出未贴壁细胞悬液,将此悬液接种于另一新的培养瓶中,旧瓶仍加液体继续培养。第三阶段(持续培养):将接种的新瓶与旧瓶置于CO2培养箱中,培养7 d后全量换液。以后每3~4天半量换液,连续培养30 d。

  1.6镜下观察细胞形态倒置相差显微镜下每日观察细胞的生长情况和形态特征,并用数码相机拍片记录。

  1.7传代方法培养30 d后的细胞,用D-Hank′s液冲洗2~3遍,加入少许0.25%胰蛋白酶,晃动后使液体铺满整个培养瓶,弃去酶液,置入CO2培养箱中消化3 min,取出镜下观察可见细胞已收缩呈球状。加入10 ml完全培养基终止反应,晃动培养瓶,可见细胞团脱落,用吸管吹打,等份分配于2个新培养瓶中。置于CO2培养箱中。72 h后换液。

  1.8间充质干细胞鉴定方法

  1.8.1诱导分化为成骨细胞的方法传至第3代的细胞加入5 ml成骨诱导分化液,隔日换液,培养3~4周后,茜素红S染色。染色步骤:用75%酒精固定细胞30 min,茜素红S滴染3~5 min,吸干染液,丙酮洗数秒,丙酮二甲苯(1∶1)洗数秒,二甲苯透明2次,镜下观察。

  1.8.2流式细胞仪鉴定方法反复吹打消化好的第3代细胞,调整细胞密度为2×106个/ml置于EP管中,加入相应抗体,室温下放置30 min,上机检测。

  2结果

  2.14份脐静脉血中有3份最终培养出呈漩涡状密集生长的间充质细胞。

  2.2细胞形态观察结果经过15 h的“短暂培养阶段”,贴壁细胞较多,呈圆形。在“持续培养阶段”,培养3 d后细胞变成梭状,核细长膨大,位于细胞中间(图1)。这类梭形细胞初期增殖能力较强,随培养时间延长,细胞数量逐渐减少,最终余下的细胞可长期生存,不再增殖。10 d左右出现多核细胞,细胞体积增大(图2),初期为圆形,有1个或数个核;20 d后,细胞核增多。这类细胞聚集成群,不增殖,可长期培养。继而出现呈漩涡状排列,密集生长的细胞(图3),培养30 d后这类细胞占优势,其它几类细胞逐渐减少。

  2.3间充质干细胞鉴定结果

  2.3.1成骨细胞诱导试验从脐血中分离的漩涡状生长的细胞,加入成骨细胞诱导分化液 10 d左右,细胞表面出现少量 四方形结晶物。随培养时间延长,结晶物逐渐布满细胞表面。该类结晶物与细胞结合较为紧密,用液体冲洗不易脱落。经茜素红S染色,细胞表面结晶物呈橘红色(图4)。

  2.3.2流式细胞仪鉴定结果经“三阶段法”分离的漩涡状生长的细胞,CD34-(>90%)为阴性(图5 a);CD44+(18.6%)(图5 b)、CD105+(40.7%)(图5 c)、CD29+(92%) (图5 d)均为阳性。图1 脐静脉血培养3 d后的贴壁细胞图2脐静脉血培养10 d后的多核细胞(10×10)图3培养20 d后人脐静脉血间充质细胞漩涡状密集生长(4×10)图4茜素红S染色的人脐静脉血间充质细胞分化的成骨样细胞(20×10)A: CD34-PEB: CD44-FITCC: CD105-PED: CD29-PC5图5免疫表型表达

  3讨论

  从脐血中分离的漩涡状生长的细胞,经免疫表型分析:不表达造血细胞的抗原(CD34-);表达间充质干细胞的抗原(CD29+、CD44+、CD105+),说明这类细胞具有间充质干细胞的特征。间充质干细胞应具有向成骨方向分化的能力。本 研究所培养的细胞在成骨细胞诱导分化液作用下,细胞外有大量的钙化结节形成,说明具有向成骨方向分化的能力。进一步说明该类细胞具有间充质干细胞特性。本研究培养了4份脐静脉血样(38~42周孕龄),有3份血样培养出间充质干细胞,这可能与血样差异有关。Campagnoli等[6]研究发现随着孕周的增加,脐血单个核细胞中含有的成纤维样贴壁细胞数目逐渐减少。经过观察进一步发现,4瓶血样前20 d均有梭形贴壁细胞产生,其数量及形态基本一致。但20 d后只有3份血样培养出间充质细胞。也就是说不同血样可能含有的间充质细胞数量存在差异,而与其它贴壁细胞数量及种类关联性较小。本实验中发现,接种于96孔板的脐血有核细胞经20~30 d培养,仅有少数的几孔出现漩涡状生长的细胞,说明这类细胞所占比例较小。这与Wexler等[7]认为脐血中MSCs较稀少甚至缺乏的研究结果类似。间充质干细胞在脐血中数量少可能是流式细胞仪分离纯化法、免疫磁珠纯化法结果不理想的原因之一。为了获得最大量的间充质干细胞,在“去除红细胞阶段”采用了明胶去除红细胞法,此法能保留最大量的各类有核细胞,从而保证比例较少的间充质干细胞能最大程度地被保存下来。本实验增加了体外培养15 h后换培养瓶的“短暂培养阶段”,其目的是减少脐血中分化较完全的有核细胞对间充质细胞生长的影响。本实验中旧瓶与新瓶同时进一步培养,2瓶中均有间充质细胞产生。镜下观察2瓶中分化较完全的有核细胞数量明显减少。其原因在于:分化较完全的有核细胞贴壁时间早于间充质细胞,而培养15 h,前者大部分正处于刚贴壁而未牢固阶段,后者还未贴壁;晃动培养瓶,已贴壁的前者被强制拔起,破坏了细胞膜,再次把细胞移入新培养瓶中时,这类细胞贴壁能力减弱,从而达到了在旧瓶及新瓶中均减少分化完全的有核细胞的目的。而间充质细胞贴壁较晚,无论在旧瓶中的剩余间充质细胞还是新瓶中移入的间充质细胞均保持完整膜结构,所以2瓶中均可培养出间充质细胞。

  本实验根据脐静脉血有核细胞培养特点设置了“持续培养阶段”。其目的是等待培养初期产生的梭形细胞增殖能力降低,数量减少,从而间充质细胞逐渐增多。在培养初期产生的梭形细胞增殖能力提升较快,数量较多,但在培养20 d左右增殖能力明显降低,细胞不再增殖,传代能力差,赵书平等[8]把这类细胞命名为“PSC3445多潜能干细胞”,其贴壁时间与间充质细胞相近,两类细胞不易通过贴壁方法分离。而间充质细胞在培养20 d后增殖能力增强,细胞数量逐渐增加。可能与梭形细胞对间充质细胞有一定的滋养作用有关。

【参考文献】
   [1]Lee MW, Choi J, Yang MS, et al. Mesenchymal stem cells from cryopreserved human umbilical cordblood[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,320(1):273.

  [2]Gang EJ, Hong SH, Jeong JA, et al. In vitro mesengenic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,321(1):102.

  [3]Lee OK, Kuo TK, Chen WM, et al. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilicalcord blood[J]. Blood, 2004,103(5):1669.

  [4]Newsome PN, Johannessen I, Boyle S, et al. Human cord blood-derived cells can differentiate intohepatocytes in the mouse liver with no evidence of cellular fusion[J]. Gastroenterology,2003,124(7):1891.

  [5]向静,王景周.脐血间质干细胞:神经干细胞的新来源[J].中国临床康复,2005, 9(17):151.

  [6]Campagnoli C,Roberts IAG, Kumar S, et al. Identifieation of mesenchymal stem/progenitor cells inhuman first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow[J]. Blood, 2001,98(8):2396.

  [7]Wexler SA, Donaldson C, Denning-Kendall P, et al. Adult bone marrow is a rich source of humanmesenchymal stem cell but umbilical cord and mobilized adult blood are not[J]. Br JHaematol,2003,121(1):105.

  [8]赵书平,沈茜,于丽华,等.人脐血PSC3445多潜能干细胞体外分离培养与鉴定[J].第四军医大学学报,2004;25(11):964-968.

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