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乳腺癌患者骨髓中CK19mRNA的表达及临床意义

首席医学网      2009年04月16日 14:20:46 Thursday  
 
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作者:黄艳春, 阿先古丽·阿不力孜, 封敏    作者单位:新疆医科大学附属肿瘤医院检验科, 新疆乌鲁木齐830011

【摘要】    目的:探讨乳腺癌患者骨髓中CK19mRNA的表达及其临床意义。方法:应用RTPCR技术检测48例乳腺癌患者和20例乳腺良性病变患者骨髓中的CK19mRNA表达并分析CK19mRNA表达与临床病理因素的关系。同时应用电化学发光技术检测其外周血中CEA和CA153的表达情况。结果:48例乳腺癌患者中15例CK19mRNA阳性,阳性率为31.25%;乳腺良性病变患者骨髓中未检测到CK19mRNA的表达。CK19mRNA表达与乳腺癌分期有关(P<0.05),与年龄和淋巴结转移状况无显著性相关(P>0.05),与外周血中CEA(r=0.329,P=0.002)和CA153(r=0.312, P=0.002)异常升高呈正相关。结论:CK19mRNA可作为检测乳腺癌患者骨髓微转移的分子指标之一,可为乳腺癌患者的治疗和预后判断提供帮助。

【关键词】  乳腺肿瘤 骨髓微转移 细胞角蛋白19 逆转录聚合酶链反应

  Expression and clinical significance of cytokeratin 19 in bone narrow of patients with breast cancer

  HUANG Yanchun,  Axianguli·Abulizi, FENG Min

  (Department of Clinical Laboratory, Affiliated Tumor Hospital, Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, China)

  Abstract:  Objective: To evaluate expression and clinical significance of cytokeratin19 (CK19) in bone marrow of patients with breast cancer. Methods: Expression of CK19mRNA in bone marrows of 48 breast cancer patients sand 20 benign breast disease patients were detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). Correlation of CK19mRNA expression to clinicopathologic features of the 48 breast cancer patients was analyzed. At the same time, expression of carcinoembryonic antigen (CEA) and CA153 in blood of 48 breast cancer patient sand 20 benign breast disease patients were measured by electrochemiluminescence immuneoassay (ECLIA). Results: Positive rate of CK19mRNA was  31.25% in the 48 breast cancer patients, and 0 in the 20 benign breast disease patients. Expression  of CK19mRNA was positively correlated with clinical stage (P<0.05), but was not related to age and lymph node status (P>0.05). In addition, positive rate of CK19mRNA was positively correlated with CEA (r=0.329, P=0.002) and CA153 (r=0.312, P=0.002) in peripheral blood. Conclusions: CK19mRNA may be used as a molecular marker to detect bone marrow micrometastasis in patients with breast cancer. The detection may help to select proper therapy and predict prognosis of breast cancer patients.

  Key words: breast cancer; bone marrow micrometastasis; cytokeratin19; reverse transcriptionpolymerase chain reaction

  乳腺癌是妇女中最常见的恶性肿瘤,是危害妇女健康的主要恶性肿瘤。全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌,有50万妇女死于乳腺癌。而影响其预后的主要原因是远处转移。临床发现有近30%腋窝淋巴结阴性患者于术后5年内出现复发、转移而导致死亡[1]。原因是肿瘤细胞在早期即发生远处转移,而血行播散是乳腺癌转移的重要途径。骨髓独特的解剖及血流特点,易导致瘤细胞的集聚并形成转移灶,因此,乳腺癌易发生骨转移,成为影响患者预后的重要因素。因而寻找敏感且可靠的检验乳腺癌微转移的标志物变得更为紧迫。细胞角蛋白19(Cytokeratin19,CK19)是目前常用的分子标志物,分布于上皮细胞,在上皮类肿瘤有表达,在间叶组织如血液、骨髓中则无表达。本研究应用RTPCR技术对48例乳腺癌患者骨髓中CK19mRNA进行检测,旨在探讨乳腺癌患者骨髓中CK19m RNA的表达及其临床意义。

  1资料与方法

  1.1标本来源收集新疆医科大学附属肿瘤医院2006年9月~2008年4月乳腺癌初治病例48例,年龄26~62岁,中位年龄44岁,均经病理检查确诊,患者术前均未接受过放疗、化疗等治疗。其中临床分期(UICC恶性肿瘤TNM分类,第5版, 1997):Ⅰ期6例,Ⅱ期16例,Ⅲ期15例,Ⅳ期11例。另选取20例乳腺良性病变患者20例作为对照,年龄22~58岁,中位年龄40岁。

  1.2标本的采集和处理对所有乳腺癌患者及乳腺良性病变者于化疗或放疗、手术前取髂前或髂后为穿刺点,取骨髓5 ml(EDTA抗凝),淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离,加入Trizol试剂1 ml于-80℃保存。同时取外周血4 ml(不抗凝),离心后取血清置于-80℃冰箱中保存,备日后进行电化学发光检测CEA和CA153。

  1.3主要仪器和试剂Roche实时荧光定量PCR 仪(Roche公司),PCR试剂盒购自上海久盛公司。Elecsys2010 仪器(Roche公司)及配套的CEA和CA153 试剂盒及相关用品。

  1.4RTPCR 检测方法 

  1.4.1RNA提取取保存的骨髓用淋巴细胞分离液分离有核细胞,将有核细胞收集到1.5 ml管中(进口、无菌),15 000 r/min离心5 min,取上清液,在沉淀中加入Trizol 500 μl混匀置室温10 min,加上氯仿200 μl混匀,10 000 r/min  10 min 4℃离心,汲取上层水相于1.5 ml管中,并加入3倍体积异丙醇(预冷)混匀,置冰上20 min,离心15 000 r/min离心15 min(沉淀RNA)。弃上清液,加入75%乙醇200 μl漂洗一次,快速离心吸干液体(注意保留沉淀的RNA),气干后加入无菌DEPC水20 μl溶解RNA。

  1.4.2逆转录标本处理后的RNA 70℃预变性5 min,迅速置于冰浴以防RNA复性;按每个反应取RT反应液18 μl、RNA1 μl、RNasin 1μl计算加于一总的无菌离心管中,混匀;用微量加样器在每个反应管中加入20 μl上述反应液;加入预变性的RNA 5 μl,37℃水浴反应30 min。

  1.4.3PCR反应按每个反应取PCR反应液23 μl、Taq酶2 μl计算加于一总的无菌离心管中,混匀;用微量加样器在每个反应管中加入25 μl上述反应液;并加入RT反应产物5 μl,按如下条件进行扩增。(同法加入标准品,阳性和阴性对照),反应条件为94℃ 5 min预变性后,94℃ 30 s,62℃ 30 s,72℃ 30 s均循环40次,72℃终止延伸10 min,4℃保存;根据所获得的标准曲线,得到各检测标本的浓度(基因拷贝数/ml)。

  1.5化学发光法检测CEA和CA153所用仪器为瑞士罗氏公司生产的全自动电化学发光免疫测定仪Elecsys2010及配套的CEA和CA153试剂盒及相关用品进行检测。CEA结果以﹥3.400 0 μg/L为阳性,CA153结果以﹥25.000 U/ml为阳性。

  1.6统计学处理应用SPLM软件对数据进行统计学分析,采用χ2 检验和秩和检验,检验水准α=0.05。

  2结果

  2.1乳腺癌和乳腺良性疾病患者骨髓中CK19mRNA的表达48例乳腺癌患者中有15 例CK19mRNA阳性,阳性率31.25%;20例乳腺良性疾病患者骨髓CK19 mRNA表达均为阴性。

  2.2乳腺癌患者临床病理学特征与骨髓中CK19的mRNA表达的关系CK19 mRNA 的表达与乳腺癌患者的TNM分期之间有明显相关性(P<0.05),提示检测乳腺癌患者骨髓有助于肿瘤的分期和治疗方案的选择。而与患者的年龄、腋窝淋巴结状态、病理类型等均无明显关系(P>0.05)(表1)。

  表1乳腺癌患者临床病理学特征与骨髓中CK19的mRNA表达的关系(略)

  2.3乳腺癌患者骨髓中CK19mRNA表达与血清中CEA和CA153含量的关系48例乳腺癌患者均采用ECLIA法检测外周血CEA和CA153的含量,其中有19例患者CEA的含量超过正常上限值;有16例患者CA153的含量超过正常上限值。骨髓中CK19mRNA表达与血清中CEA(r=0.329,P=0.002)和CA153(r=0.312,P=0.002)呈正相关。

  3讨论

  近年来,随着分子生物学技术的发展,RTPCR技术已用于检测乳腺癌骨髓微转移细胞中特异mRNA 的表达,此方法灵敏度高,特异性强[2]。但由于目前乳腺癌缺乏可供检测的特异性分子标志物,而组织特异性标志物常有假阳性。因此,筛选特异性高的乳腺癌标志物是提高乳腺癌微转移检测特异性和可靠性的关键。细胞角蛋白(cytokeratin,CK) 是细胞骨架系统中间丝组成成分之一,CK 广泛存在于上皮组织细胞中,而在间叶组织(如血液、骨髓、淋巴结等) 中缺乏表达,因此它已成为上皮细胞和上皮性肿瘤细胞较为敏感和特异的标志物[3-4]。本实验结果显示,20例乳腺良性疾病患者骨髓中CK19mRNA表达均为阴性,而在乳腺癌骨髓中CK19mRNA表达阳性率为31.25%,两者比较差异有统计学意义。表明CK19mRNA 作为标志物,检测乳腺癌骨髓微转移具有较高的特异性,提示CK19 mRNA有可能作为检测乳腺癌微转移的肿瘤标志物。本实验结果表明,CK19mRNA的表达与乳腺癌患者的TNM分期差异有统计学意义,提示检测乳腺癌患者骨髓有助于肿瘤的分期和治疗方案的选择。另外发现CK19在骨髓中的表达随着肿瘤的增大,阳性率增加,这表明随着肿瘤负荷的增大,转移的可能性随之增加,但无统计学意义,需要增加病例继续研究。荧光定量RTPCR的检测敏感性,有报道可达1∶10[5-6]。由于RTPCR 方法灵敏度高,如何避免污染造成假阳性至关重要,本研究在标本采集过程中,首先将抽取的骨髓常规送涂片检查,然后抽取的骨髓用于实验。实验用品均为一次性使用,操作过程戴帽子、口罩,以最大限度保证实验的可靠性。CEA是一种癌胚抗原,主要表达于胚胎性肿瘤、肺、胃肠、乳腺癌组织。它可以促进肿瘤细胞与正常细胞的结合,并对肿瘤的转移起重要作用。CEA属于上皮组织特异性标志物,在正常人的间叶组织不表达,为检测外周血中微转移提供了可能。在乳腺癌患者的血清中检出CEA的异常高含量,则表明可能是乳腺癌微转移的结果。本研究结果显示,骨髓中CK19mRNA表达与血清中CEA的含量呈正相关。两者联合检测更有助于提高微转移检测的特异性,减少假阳性。CA153是由单克隆抗体115D8和DF3识别的粘蛋白型糖蛋白MUC1抗原上的表位。存在于乳腺、肺、卵巢、胰腺等恶性的或正常的上皮细胞膜上。MUC1乳腺癌粘蛋白(CA153抗原)由肿瘤细胞分泌,可作为乳腺癌的血清学标志。本研究结果显示骨髓中CK19mRNA表达与血清中CA153的含量呈正相关。二者联合检测更有助于提高微转移检测的特异性。综上所述,骨髓中CK19mRNA作为乳腺癌的一项分子检测指标,能反映肿瘤细胞的全身播散状况,为乳腺癌判断和动态监测病情、指导治疗提供更准确的依据。联合外周血CEA、CA153的检测对于预测术后复发转移和判断预后等更有指导意义。多数学者研究认为,骨髓微转移与不良预后有关,是一个独立的预后因素。但也有学者认为无论是淋巴结还是骨髓,均为正常或肿瘤性上皮细胞的清理部位,阳性信号可能仅代表免疫系统清除和过滤循环中肿瘤细胞的一种功能反应。我们认为,乳腺癌骨髓微转移的检测不仅可以正确划分肿瘤的临床分期,而且可以判断预后。RTPCR 方法是目前检测骨髓微转移灵敏、特异手段之一,阳性结果至少提示具有形成转移的倾向。由于病例数较少, 应扩大样本量和长期随访以进一步明确其应用价值。

【参考文献】
    [1]De Vita VT Jr. Breast cancer therapy:exercising all our options[J].N Engl J Med,1989,320(8):527529.

  [2]Juenger J, Schellberg D, Kraemer S, et al. Health related quality of life in patients with congestive heart failure[J]. Heart ,2002,87(3):235241.

  [3]Smith RF, Johnson G, Ziesche S, et al. Functional capacity in heart failure. Comparison of methods for assessment and their relation to other indexes of heart failure. The V2HeFT VA Cooperative Studies Group[J]. Circulation,1993,87(6 Suppl):8893.

  [4]Alla F, Briancon S, Guillemin F, et al. Selfrating of quality of life provides additional prognostic information in heart failure. Insights into the EPICAL study[J]. Eur J Heart Fail,2002,4(3):337343.

  [5]Gorkin L, Norvell NK, Rosen RC, et al. Assessment of quality of life as observed from the baseline data of the studies of left ventricular dysfunction ( SOLVD) trial quality of life substudy[J]. Am J Cardiol,1993,71(12):1 0691 073.

  [6]Paul S, Sneed N. Patient perceptions of quality of life and treatment in an outpatient congestive heart failure clinic[J].Congest Heart Fail,2002,8(2):7479.

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