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简易大鼠脊髓完全横断伤模型的建立

首席医学网      2009年04月16日 14:14:08 Thursday  
 
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作者:郑新峰, 郭海龙, 盛伟斌, 金格勒, 姜涛, 张春, 荀传辉, 陈浩贤    作者单位:新疆医科大学第一附属医院脊柱外科, 中心实验室, 新疆乌鲁木齐830011

【摘要】    目的:建立一种简便、可靠的完全脊髓横断伤模型的制作方法。方法:成年SD大鼠21只,随机分为横断伤组、挫伤组、对照组,每组7只。显露T12脊髓,横断组用尖刀将其完全横断。挫伤组150克·厘米力(gcf)冲击致伤。对照组仅显露脊髓,不做特殊处理。在不同时间对各组大鼠行行为学(BBB)评分及组织学评价。结果:横断组大鼠后肢功能评分在损伤后3~4周趋于稳定,损伤后4周时BBB评分为(5.14±0.80)分;挫伤组后肢功能评分进行性增高,4周时BBB评分达到(11.21±2.21)分;对照组2周左右恢复正常。横断组大鼠组织学观察见损伤区无脊髓组织残留,神经丝(NF)免疫组化染色未见神经纤维通过损伤区。结论:通过完全脊髓横断可以制备出稳定性好、一致性高的脊髓损伤模型。完全脊髓横断后,损伤恢复3~4周左右趋于稳定,可作为慢性脊髓损伤修复的移植期。

【关键词】  脊髓损伤 动物模型 大鼠 移植

  Establishment of spinal cord transective injury model in rats

  ZHENG Xinfeng,  GUO Hailong,  SHENG Weibin,  et al

  (Department of Spine Surgery,  First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

  Abstract: Objective: To invistigate a simple and reliable methed of spinal cord transective injury  model in rats. Methods: Twenty one  adult SD rats were randomized to classified 3 groups as transection group, contusion group and control group. The spinal cord was cut completely in transection group, impacted with 150 gcf (gram cm force)  in contusion group and control group without disposal at the level of T12 after spinal cord exposed. The behavioral score of the rat was recorded at different time and pathological changes were evaluated. Results: The BBB (Basso, Beattie and Bresnahan) scores of 4 week reached 5.14±0.80 points in transection group and 11.21±2.21 points in contusion group, and the control group recovered to normal in about 2 weeks. No spinal cord residual tissue was discovered in the damaged area of the spinal cord transection group by histological examination. AntiNF staining showed no continuous NF passed through the lesional area in transection group. Conclusion: The model of spinal cord transection injury in rats could be used for the spinal cord regenerated research. The model had the feature of simplicity and reality. Spinal cord transection injury was to reached stable after 3~4 weeks and could be used as chronic spinal cord injury model for transplantion.

  Key words: spinal cord injury; animal model; rat; transplantion

  脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是严重危害人类健康的疾病,损伤后的病理生理机制非常复杂。为了寻求新的、有效的治疗,更透彻地阐明脊髓损伤所涉及的复杂机制,更有效地评估脊髓损伤后干预手段的效果,需要有可靠性高、重复性好的脊髓损伤模型。脊髓全横断动物模型即保证了模型的一致性,也排除了脊髓挫伤后功能自我恢复的影响。瘫痪恢复与否完全取决于脊髓传导功能能否以及在多大程度上恢复,为神经轴突再生研究提供了一定的价值[1]。本文介绍一种简便、可靠的脊髓完全横断模型的建立方法。

  1材料与方法

  1.1实验动物成年清洁级SD大鼠21只,体重220~280 g,雌雄不限(由新疆医科大学动物实验中心提供)。随机分为横断组、挫伤组、对照组,每组各7只,并对实验中死亡动物进行补充。本实验通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审批,实验中尽可能减少动物使用数量和动物的痛苦。

  1.2模型制备适应性饲养1周后,10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔麻醉,胸背部剃毛备皮并固定。取俯卧位,无菌操作下在胸背部棘突最高点为中心做长约1 cm正中切口,逐层切开皮肤及皮下筋膜,紧贴棘突和椎板骨膜下剥离两侧竖脊肌,暴露T9~T11棘突和椎板。咬除T9~T10棘突,小心咬除T10椎板并打开椎管,充分暴露硬膜囊背面及两侧,操作中尽量不碰到硬膜囊。横断组用小尖刀将脊髓在T12节段完全横断,反复切割3~4次并抬起断端确定脊髓完全横断。纱布轻压断端止血,生理盐水冲洗,明胶海绵覆盖断端,缝合切口两侧肌肉填充椎板切除后缺损并逐层缝合筋膜及皮肤,制成脊髓完全横断伤模型。挫伤组充分显露椎管及硬膜囊后,30   g冲击棒沿玻璃管自5 cm高度垂直下坠致伤脊髓。冲击棒下端直径 3 ml,致伤能量为 150克·厘米力(gram cm force, gcf)。对照组只显露硬膜囊即关闭切口。所有大鼠术后皮下补生理盐水2 ml。

  1.3术后护理将大鼠放入温暖、洁净、备有食物和水的鼠笼。室温维持在18~22℃,自由进食水。术后皮下注射头孢唑啉针0.1 g/d,补液2 ml/d,共3~5 d。每日人工膀胱按摩排尿两次,持续1~2周,直到大鼠自主排尿,同时观察尿液颜色和清亮度。每次挤尿前先被动活动大鼠双后肢50下,预防后肢静脉血栓和褥疮形成。挤尿时,以手指触摸找到充盈的膀胱,轻柔按摩膀胱底部,自上而下挤压膀胱排尿。挤压时耐心轻柔,切忌粗暴用力。对术后膀胱感染的大鼠,给予氧氟沙星0.01 g/d或头孢曲松钠0.075 g/d皮下注射,连续3~5 d,至尿液清亮后再用1 d。

  1.4行为学评价所有大鼠在术后3 d及术后1、2、3、4周分别行BBB(Basso, Beattie and Bresnahan)评分。将大鼠置于动物手术操作台,观察大鼠的髋、膝、踝关节、行走、躯干、尾部运动以及协调情况。每次评分均在下午7点排尿后进行,观察时间5 min。所有评分均由两名不参与建模的医师完成。二者同时观察,独立评分,最后取均值作为评分值。

  1.5组织学评价所有大鼠脊髓组织均行HE染色、NF200免疫组织化学染色。置于光镜下观察脊髓损伤区及临近部位组织结构。

  1.6统计学方法用SPSS13.0统计分析软件对实验数据进行统计分析,计量资料采用均数±标准差(±s)表示,3组间比较应用重复测量资料方差分析,检验水准α=0.05。

  2结果

  2.1术后一般情况大鼠在术后2 h左右完全清醒,靠前肢爬行。所有横断伤和挫伤组大鼠均出现了典型截瘫表现,表现为活动较少,常伴有腹部胀气、大便困难伴硬结、尿潴留,双后肢肌张力低、肌力减低、双后肢拖行。3 d后有不同程度的恢复,伴有后肢肌肉不同程度的萎缩,尤以横断组严重。术后第2天人工排尿,9只可见肉眼血尿,横断组7只,挫伤组2只,术后3~4 d自行消失。至10 d个别大鼠恢复自主排尿,2周左右所有大鼠形成反射性膀胱,可自行排尿。对照组术后无大、小便异常,后肢肢运动功能大多数在术后3 d恢复正常。所有大鼠切口均愈合良好,无感染,部分大鼠缝线3周左右自动脱落,个别缝线不脱落。整个实验过程中因各种原因死亡的大鼠共6只,横断组5只,挫伤组1只,死亡率14.3%。因麻醉过深死亡1只,大便贮留2只,挤尿时致膀胱破裂1只(雄性),不明原因2只。横断组大鼠术后发生尿路感染3只,均在给予抗生素注射后恢复。表现为尿液浑浊呈浓性或伴血性,发生于停用抗生素后3~5 d,而自主膀胱反射尚未恢复时。

  2.2大鼠行为学测试结果3组大鼠后肢肢功能BBB评分分组结果差异有统计学意义(P=0.000),且评分时间与分组有交互作用(P=0.000)。提示不同建模方式对大鼠后肢功能恢复的影响不同,建模后大鼠后肢功能逐渐改善(表1)。对照组大鼠在术后3 d时BBB评分为(19.79±0.57)分,主要表现为行走不稳和尾部下垂,术后2周左右恢复正常。挫伤组大鼠术后3 d时BBB评分为(1.64±0.90)分,至2周部分大鼠恢复后肢负重,无前后肢协调运动,BBB评分为(7.14±1.95)分。4周时仅1只大鼠无法满足在负重状态下脚掌着地,3只有不协调的前后肢运动,3只前后肢协调运动,BBB评分为(11.21±2.21)分。横断组大鼠后肢运动能力有轻微的恢复,3 d时BBB评分为(0.29±0.39)分,2周全部大鼠出现1个以上后肢关节的广泛活动,BBB评分为(3.79±1.04)分。4周时后肢3个关节均可见轻微到广泛的活动,BBB评分为(5.14±0.80)分,其中1只大鼠BBB评分达7分。

  2.3大鼠脊髓损伤组织学变化建模后4周时,对照组大鼠脊髓硬脊膜光滑、完整,表面无瘢痕、粘连。挫伤组及横断组可见损伤区脊髓变细,硬脊膜表面不光滑,瘢痕形成。镜下见对照组大鼠HE染色可见白质内神经纤维沿脊髓纵轴方向排列有序,灰质细胞分布均匀、排列紧密,灰白质界限清晰,细胞分布均匀,纤维排列有序(图1)。NF200免疫组化可见沿脊髓纵轴方向排列有序的呈棕黄色的阳性神经纤维(图2)。挫伤组大鼠HE染色可见脊髓组织部分坏死崩解造成的组织碎片、碎屑,灰白质界限不清,白质内神经纤维排列紊乱,可见较大空洞形成(图3)。NF200免疫组织化学染色脊髓腹侧面可见沿纵轴方向排列的呈棕黄色的阳性神经纤维,但在坏死、瘢痕区未见明显阳性纤维(图4)。横断组脊髓断端几乎完全被瘢痕填充,连接脊髓断端(图5),瘢痕内无再生神经纤维(图6)。

  表13组大鼠后肢运动BBB评分法观察结果(略)

  注:分组对大鼠后肢功能BBB评分的影响有统计学意义(F=90.620, P=0.000);且评分时间与分组有交互作用(F=16.854, P=0.000);3组两两比较差异均具有统计学意义(P=0.000)

  图1对照组脊髓纵切(HE×40)(略)

  图2对照组脊髓纵切(NF200×40)(略)

  图3挫伤组脊髓纵切(HE×40)(略)

  图4挫伤组脊髓纵切(NF200×40)(略)

  图5横断组脊髓纵切(HE×40)(略)

  图6横断组脊髓纵切(NF200×40)(略)

  3讨论

  理想的SCI模型应具备以下三方面条件:(1)临床相似性,即制作的SCI模型应与临床相近似,尽量接近人类的情况;(2)可调控性,即可根据实际需要调整损伤强度,复制出不同损伤程度的SCI模型;(3)可操作性与可重复性,即对SCI模型制作的各关键步骤客观化、定量化,使其可信度高、可实施性强,能反映客观问题[2]。Allen重物坠落法(weight drop,WD),即用重物由一定高度坠落打击开放的动物脊髓来制作该模型[3]。该模型与人类SCI的性质非常相近,是目前为止与人类SCI相关性最好的一种方法。两者均属一定力量撞击后造成脊髓水肿、缺血并继发一系列损伤反应至SCI的典型表现。该法保持了硬脊膜完整,可有效防止外源性成分侵入SCI区域,并防止脊髓外露与脑脊液外漏[4]。但动物模型与临床SCI仍有很大区别,前者是切开背部皮肤后对开放脊髓后部的直接损伤[5],而后者则是因撞击所致挫伤或椎骨错位、对封闭脊髓前部与侧部的压迫式损伤[6]。我们的实验中挫伤模型采用30 g冲击棒自5 cm高下落建模。为防止打击区域的偏差,应用玻璃管作为打击通道,但也可能增加冲击棒下落时的摩擦力,可能导致打击的力量不一致。4周时挫伤组大鼠BBB评分(11.21±2.21)分,大体标本可见局部变细,瘢痕形成,镜下见脊髓组织部分坏死崩解造成的组织碎片、碎屑,以及囊腔、瘢痕形成,证实挫伤模型建立成功。但模型行为学评分跨度较大、一致性差,4周时BBB评分在8~15分内。这可能是由于当重物下落撞击脊髓时,不能及时移开,导致脊髓继续受压而造成新的损伤,或打击位置区域偏差、打击时脊髓的相对位移造成损伤区域与程度不同。且组织学可见在脊髓损伤腹侧有神经纤维残留,在动物实验中大鼠后肢功能的恢复很难确定是治疗的效果还是自行恢复的作用。因此,设计制造或引进应用仪器化、计算机化、智能化的WD仪,使下落重物质量、下落高度、速度和势能、垫片质量与质地及面积达到一致才可能使SCI挫伤模型更一致,使SCI修复的实验结果更有说服力。这也局限了脊髓挫伤模型在实验中的应用。另一种得到公认的SCI模型是脊髓横断模型。该模型的制造是使用锐利刀片横断[1]或半横断脊髓[7]。我们实验中采用手术尖刀反复切割3~4次,并抬起断端证实脊髓完全离断的方法建立脊髓横断伤模型。术后大鼠行为学评分缓慢增高,4周时BBB评分为4~7分,平均(5.14±0.80)分。观察期内可见大鼠后肢运动能力有轻微的恢复,后肢两个以上关节的大幅活动,但不能达到负重要求。镜下观察可见断端胶质瘢痕形成,硬膜瘢痕长入脊髓断端,并空洞、囊腔形成,至3~4周时靠纤维瘢痕连接。轴突无法穿越瘢痕和囊腔,在瘢痕下扭曲,损伤区内未见轴突通过,证实模型建立成功。我们的研究证实,脊髓完全横断后大鼠后肢运动功能可得到部分缓慢的恢复,3~4周时BBB评分达到5分左右并趋于平稳,最高评分可达7分。可见,脊髓完全横断模型伤口清楚、继发反应轻、放置移植物或药物等进行再生性实验研究方便,利于SCI再生与修复等研究。由于实验中未见神经丝穿越瘢痕,既无下行纤维的直接支配的自主运动,也无上行纤维传导冲动引发的反射性肢体运动,如顺行或逆行追踪观察到远端标记轴突,则意味着轴突成功再生。目前所使用的各种脊髓损伤模型中,仍没有一个完善的可以满足所有条件的模型。不同SCI模型,导致不同类型的解剖结构损伤与神经功能变化,因此在实验中要尽可能的根据实验方法和目的选择合适的SCI模型。应用尖刀直接完全横断脊髓建模的主要优点是操作相对简单,解剖定位准确,重复性好,损伤程度较恒定,功能障碍确定。由于完全横断脊髓,横断面以下的运动和感觉功能完全丧失,造成的功能障碍直接归因于脊髓横断原发损伤,使其形态学及功能的恢复完全取决于对其采取的干预措施,对脊髓损伤修复的研究很有价值[8]。我们认为,模型鼠在术后2周后恢复减慢,3周后趋于稳定,因此慢性损伤期移植的时机可选择在2~4周。

【参考文献】
    [1]Iseda T, Nishio T, Kawaguchi S, et al. Spontaneous regeneration of the corticosp inal tract after transection in young rats:a key role of reactive astrocytes in making favorable and unfavorable conditions for regeneration[J]. Neuroscience, 2004,126(2):365374.

  [2]祖波, 尹宗生. 机械性脊髓损伤模型的建立及其评价[J]. 中国临床康复, 2006,10(12):151153.

  [3]Allen AR. Surgery of experimental lesions of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation[J]. JAMA, 1911, 57: 878880.

  [4]Kaptanoglu E, Tuncel M, Palaoglu S, et al.Comparision of the effects of melatonin and methylprednisolone in experimental spinal cord injury[J]. J Neurosurg, 2000, 93(Suppl):7784.

  [5]韩雯, 刘文娟, 张富洪, 等. 脊髓腹侧压迫损伤后cFos蛋白表达的实验研究[J]. 新疆医科大学学报, 2008, 31(9):11671169.

  [6]Amar AP, Levy ML. Pathogenesis and pharmacological strategies for mitigating secondary damage in acute spinal cord injury[J]. Neurosurgery, 1999, 44:10271039.

  [7]YickL W, Wu W, So KF, et al. Chondroitinase ABC promotes axona regeneration of Clarkes' neurons after spinal cord injury[J]. Neuro Report, 2000, 11(5):10631067.

  [8]Talac R, Friedman J. A, Moore MJ, et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue enginering treatment strategies[J]. Biomaterials, 2004, 25(9):15051510.

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