低浓度紫杉醇抑制SPCA1细胞增殖的实验研究
【摘要】 目的 研究低浓度紫杉醇（PTX）对非小细胞肺癌SPCA1细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法 用不同浓度PTX处理SPCA1细胞16 h，去除含药培养液继续培养56 h,计数细胞并计算细胞生长抑制率。用0、1.5、3和6 nmol PTX，以及PTX与10 μmol/L SP600125联合处理细胞16 h，流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡。结果 低浓度PTX可显著抑制SPCA1细胞增殖，其IC50、IC70和IC90值分别为1.75、3.25和4.50 nmol/L。0、1.5、3和6 nmol/L的PTX分别诱导（0.5±0.36）%、（17.0±0.55）%、（27.0±0.63）%和（21.0±3.02）%细胞发生凋亡，而10 μmol/L SP600125使低浓度PTX诱导的细胞凋亡显著下降。低浓度PTX也具有抑制有丝分裂的作用，0、1.5、3和6 nmol/L的PTX分别导致（22.7±1.68）%、（19.4±1.43）%、（26.2±0.97）%和（42.6±3.36）%细胞阻滞于G2/M期。结论 低浓度PTX可通过诱导细胞凋亡和有丝分裂阻滞抑制SPCA1细胞生长，而JNK激酶抑制剂可下调PTX诱导的细胞凋亡效应。
【关键词】 紫杉醇；非小细胞肺癌；凋亡
Experimental study of inhabitation of lower concentration of paclitaxel to the proliferation of SPCA1 cell
LI Yan，REN Kuang,MA Aixin,JU Xiaohong,LI Qiang,LI Wenbin (Department of Etiology，Jilin Medical College，Jilin City,Jilin Province,132013,China）
Abstract:Objective To study the effect of lower concentration paclitaxel on the proliferation,cell cycle,apoptosis and mitosis of nonsmall cell SPCA1. Methods SPCA1 cells were treated by different concentration of paclitaxel for 16 hours,paclitaxel containing medium was replaced by drug free medium.After additional 56 hours,cells were counted and the growth inhibition rates were calculated.SPCA1 cells were treated by 0,1.5,3 and 6 nmol/L paclitaxel with or without 10 μmol/L SP600125 for 16 hours,the cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry. Results Lower concentration of paclitaxel could inhibit the proliferation SPCA1 cells significantly.The IC50,IC70 and IC90 were 1.75、3.25 and 4.50 nmol/L respectively.The apoptosis rate induced by 0，1.5，3 and 6 nmol/L were（0.5±0.36）%，（17.0±0.55）%，（27.0±0.63）%，（21.0±3.02）% and （22.7±1.68）%，（19.4±1.43）%，（26.2±0.97）%，（42.6±3.36%）were blocked at G2/M phase by the same concentration of paclitaxel.The apoptosis induced by paclitaxel was reduced significantly by 10 μmol/L SP600125,a JNK inhibitor. Conclusion Lower concentration of paclitaxel inhibited SPCA1 cell growth by apoptosis induction and mitosis blocking,and JNK inhibitor could reduce paclitaxelinduced apoptosis.
Key words:paclitaxel；NSCLC；apoptosis
1991年美国FDA批准紫杉醇（paclitaxel，PTX）用于临床，迄今为止，PTX已经应用于非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer,NSCLC）、卵巢癌、乳腺癌和头颈部肿瘤等多种肿瘤的治疗［1］。PTX结合β微管蛋白，促进非功能性微管束的形成，使纺锤体不能正常装配，抑制细胞有丝分裂，最终导致肿瘤细胞死亡［2］。随着PTX在临床上的广泛应用，其不良反应也受到了重视。PTX所导致的中性粒细胞下降、神经毒性和胃肠道反应等均与剂量相关。研究PTX剂量与疗效的关系，将有助于合理降低药物剂量，减轻不良反应，保证化疗得以继续。但低浓度PTX是否能有效抑制肿瘤细胞增殖，甚至杀灭癌细胞，还需要证实。肺癌是最常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升,其中NSCLC约占80%，PTX单药或含PTX联合化疗为NSCLC主要治疗手段［3］。高浓度PTX每3周给药是NSCLC的常用治疗方案，单药有效率为35%～70%，但骨髓抑制和神经毒性的副反应发生率在60%以上［4］。研究低浓度PTX对NSCLC的抑制作用，可以为优化PTX治疗NSCLC的方案提供实验依据。我们采用体外实验，分析不同浓度PTX对NSCLC SPCA1细胞增殖的影响，以阐明低浓度NSCLC的抗肿瘤作用。
1 材料与方法
1.1 材 料
PTX购自山东鲁能制药厂；SP600125、台盼蓝和碘化丙锭购自Sigma公司；RNas A购自Roche公司；RPMI1640和新生牛血清分别购自Hyclone公司和浙江黄岩四季青生物制品有限公司。
1.2 细胞培养与药物处理
用含有10%新生牛血清的1640培养液，在5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养SPCA1细胞，细胞呈贴壁生长，采用含有0.02% EDTA的0.25%胰酶消化并收集细胞。取指数生长期细胞调配为3×104/ml的细胞悬液，接种于培养瓶，待细胞恢复贴壁后（接种后16 h）分别加入0、0.75、1.5、3、6 和12 nmol PTX，作用16 h后，采用培养液置换的方法，终止PTX作用，继续培养56 h后收集细胞,再分别用0、1.5、3和6 nmol PTX处理细胞16 h，以及上述浓度PTX与10 μmol/L的JNK激酶抑制剂SP600125联合处理细胞16 h，收集细胞后分析细胞周期和细胞凋亡。
第 2 期 李 妍,等.低浓度紫杉醇抑制SPCA1细胞增殖的实验研究1.3 细胞计数与生长抑制率计算
用PBS重悬细胞，0.4%台盼蓝染色2 min后采用医用血球计数板计数细胞，并计算细胞总数（Cell count）和细胞活力(Viability),两者的乘积为活细胞数（Viable count）。用如下公式计算细胞生长抑制率（Inhibition rate,IR）：IR（%）=（活细胞数对照组-活细胞数实验组）/活细胞数实验组×100%。
1.4 细胞周期分析
预冷的80％乙醇固定细胞，-20℃保存过夜。PBS洗涤细胞2次，向50 μl细胞悬液中加入400 μl含有10 μg/ml碘化丙锭（PI）和20 μmol/L RNase A的PBS。室温避光处理30 min后流式细胞仪检测，分析G1期、S期、G2/M期以及凋亡细胞百分率。
2 结 果
2.1 低浓度PTX抑制SPCA1细胞生长
将培养细胞持续暴露于PTX 72 h，然后分析活细胞数变化为体外抗肿瘤研究的常用方法。但资料表明，PTX经静脉给药后3～4 h血药浓度达峰值，但肝细胞内P450酶通过羟化反应加速PTX灭活，16～24 h后70%以上的药物被清除，即体外研究的模型与药物体内代谢间存在差异［5］。为模拟体内条件下PTX的抗肿瘤作用，将SPCA1细胞暴露于PTX 16 h，然后通过培养液置换方法降低培养液中药物浓度，继续培养56 h后分析细胞生长状态。结果表明，随PTX浓度增加，细胞数目明显减少，细胞活力也逐渐下降。1.5、3、6、12、24和48 nmol/L PTX对SPCA1的抑制率分别为（51.64±4.57）%、（63.27±3.36）%、（86.79±5.03）%、（93.97±4.12%）、（96.97±6.79%）和（99.68±7.16）%（表1）。采用等效线图解法（isobologram），计算抑制50%、70%和90%细胞增殖所需要的PTX浓度。PTX对SPCA1细胞的IC50、IC70和IC90值分别为1.75、3.25和4.50 nmol/L,上述实验结果表明，低剂量PTX短时间可有效抑制SPCA1细胞增殖。表1 不同浓度PTX对SPCA-1细胞生长的影响
2.2 低浓度PTX诱导SPCA1细胞凋亡
为分析低浓度PTX抗肿瘤的机制，采用流式细胞术分析不同浓度PTX对SPCA1细胞周期和细胞凋亡的影响（图1）。流式细胞分析结果表明，0、1.5、3和6 nmol/L的PTX分别诱导（0.5±0.36）%、（17.0±0.55）%、（27.0±0.63）%和（21.0±3.02）%细胞发生凋亡，上述浓度PTX分别导致（22.7±1.68）%、（19.4±1.43）%、（26.2±0.97）%和（42.6±3.36）%细胞阻滞留于G2/M期（表2）。低浓度PTX可通过诱导细胞凋亡和有丝分裂阻滞而抑制SPCA1细胞增殖。
在有丝分裂期阻滞后，通过CDC2激酶灭活抗凋亡分子Bcl2为高浓度PTX诱导细胞凋亡的主要机制，即高浓度PTX诱导细胞凋亡具有细胞周期依赖性。近年研究发现，低浓度PTX可诱导多种细胞凋亡，但诱导凋亡的机制、细胞凋亡与细胞周期的关系还不清楚［67］。转录因子cJun氨基端激酶（cJun NH2terminal kinases，JNK)可在细胞受到紫外线、渗透压、炎症因子TNFα和抗微管药物的刺激下激活，通过调节cJun的转录功能而诱导凋亡，但JNK的活化和对细胞凋亡的调节与细胞类型有关［8］。为研究PTX诱导SPCA1细胞凋亡是否与JNK途径有关，采用JNK激酶特异抑制剂SP600125与PTX共同处理SPCA1细胞，分析细胞周期和细胞凋亡的变化结果表明，10 μmol/L SP600125单独作用对细胞凋亡无明显影响，10 μmol/L SP600125与1.5、3和6 nmol/L的PTX共同作用，细胞凋亡率分别为（6.5±4.67）%、（2.8±1.45）%和（1.4±1.68）%，细胞凋亡率较PTX单独作用组显著下降（图1、表2）。
3 讨 论
PTX曾以单药化疗、联合化疗和放化疗联合的方式用于NSCLC的治疗，但最佳治疗方案至今尚未确定。在临床用药前，定量分析抗癌药物的最佳剂量和滴注时间，可以在保证疗效的同时，减少PTX的用量，以降低其毒副作用。本实验结果表明，在与体内药物代谢近似的条件下，低浓度PTX（1.5～6 nmol/L）短时间作用可有效抑制肿瘤细胞增殖。Shunichi Yamashita等报道，PTX可通过上调JNK激酶诱导多种甲状腺癌细胞凋亡，而SP600125可通过抑制JNK激酶活性，进而下调PTX诱导的细胞凋亡，并降低了PTX的抗肿瘤效应［9］。研究发现，低浓度PTX可诱导SPCA1细胞凋亡，而SP600125对PTX诱导凋亡具有抑制作用，即PTX诱导SPCA1细胞凋亡也与JNK激酶途径有关。
本研究证实，低浓度PTX短时间作用抑制SPCA1细胞生长，为临床治疗采用低剂量高频率给药的用药方案提供依据。研究药物的作用机制可为筛 表2 PTX和SP600125对细胞周期和细胞凋亡的影响*与不含SP600125的对照组比较，P<0.05
选联合化疗药物，增强肿瘤对药物敏感性提供依据。低浓度PTX诱导细胞凋亡与JNK激酶途径有关，选择对JNK激酶上调作用的制剂与PTX联合，可能增加细胞凋亡率，增强低浓度PTX的抗肿瘤效应。
【参考文献】
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