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通脉注射液对脑缺血再灌注大鼠大脑皮质神经细胞N甲基D天冬氨酸受体1 mRNA表达的影响

首席医学网      2010年11月23日 20:52:11 Tuesday  
 
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作者:朱兆洪,丁柱,刘茂才    作者单位:1. 解放军第421医院,广东广州510318;2.广东省中医院,广东广州510120

【摘要】    【目的】观察通脉注射液对脑缺血再灌注大鼠大脑皮质神经细胞N甲基D天冬氨酸受体1(NMDAR1)mRNA表达的影响。【方法】选用SD大鼠随机分为假手术组,模型组,通脉注射液高、中、低剂量组(中药高、中、低剂量组,剂量分别为2.72、1.36、0.68g·kg-1·d-1)。除假手术组外,其他组均采用改良4血管结扎法复制大鼠全脑缺血模型,取各组大鼠大脑皮质,采用原位杂交法检测各组大脑皮质神经细胞NMDAR1 mRNA阳性细胞数和染色光密度(D)值。【结果】与假手术组比较,模型组大鼠大脑皮质神经细胞NMDAR1 mRNA阳性细胞数和D值均显著增高(P<0.01或P<0.001);与模型组比较,中药高、中剂量组阳性细胞数显著减少(P<0.01或P<0.001),中药高剂量组的D值显著降低(P<0.01),而中药中、低剂量组的D值和中药低剂量组的阳性细胞数无显著变化(P>0.05)。【结论】通脉注射液治疗缺血性中风的作用与其能抑制缺血后神经细胞NMDAR1 mRNA的异常表达,减弱兴奋性神经毒性引发的神经细胞损伤有关。

【关键词】  通脉注射液/药理学;缺血性中风/中药疗法;脑/病理学;疾病模型,动物;大鼠

  缺血缺氧后脑组织出现严重的代谢紊乱,通过释放大量的兴奋性氨基酸,过度激活相应受体,导致神经细胞产生兴奋性毒性作用,引发细胞内外多种病理过程,而致神经细胞死亡[1]。兴奋性神经毒性被认为是脑损伤的始动因素[2]。N甲基D天冬氨酸受体(NMDAR)是中枢神经系统中兴奋性氨基酸谷氨酸的特异性结合受体,在中枢神经系统广泛分布,目前被认为是中枢神经系统最重要的兴奋性递质受体[3]。本研究通过观察通脉注射液对脑缺血再灌注大鼠大脑皮质神经细胞NMDAR1 mRNA表达的影响,从兴奋性神经毒性方面探讨通脉注射液治疗缺血性中风的可能机理,现报道如下。

  1材料与方法

  1.1主要药物、试剂及仪器通脉注射液为静脉用注射液,由广东省中医院制剂室提供,Mupid2plus型水平电泳仪(日本Mupid公司),BGPower 300型垂直电泳仪(中国百晶公司),原位杂交试剂盒Dig Labeling Detection Kit(美国罗氏公司)。

  1.2动物及分组雄性SD大鼠50只,体质量(270±30)g,购自第一军医大学实验动物中心,合格证号:粤检证字第99A046。将大鼠随机分为5组:模型组,假手术组,通脉注射液高、中、低剂量组(中药高、中、低剂量组,剂量分别为2.72、1.36、0.68g·kg-1·d-1)。后3组于造模前3d始分别按设计剂量腹腔注射,连续2d,第3天造模结束清醒4h后再给药1次,模型组和假手术组均以等容积的生理盐水腹腔注射。

  1.3模型复制采用改良4血管结扎法复制大鼠全脑缺血模型[4-5]。大鼠以100mg/L的水合氯醛经腹腔注射麻醉,俯卧位置,剪开头项部正中皮肤,分离颈项部肌肉,暴露横突翼小孔,电灼凝固双侧椎动脉,分层缝合。翻转大鼠改为仰卧位,分离颈总动脉,动脉夹夹闭双侧颈总动脉,造成弥漫性全脑缺血,全脑缺血15min后放开动脉夹,分层缝合。假手术组只予分离血管,而不结扎血管。

  1.4取材及组织切片再灌注24h后,常规水合氯醛麻醉,开胸暴露心脏并剪开心包,以12号针头经心尖插至升主动脉内,刺破右心耳后,分别以生理盐水150mL、40g/L多聚甲醛—磷酸缓冲液、50g/L蔗糖200mL灌注。灌注完毕后开颅取脑浸泡于20g/L蔗糖溶液,再移入0.1mol/L磷酸缓冲液中。取大脑皮质,用振荡切片机行冠状切片,切片厚为40μm。

  1.5Dig探针标记NMDAR1 cDNA探针的Dig标记及标记率按Dig Labeling & Detection Kit 说明书进行。将标准标记探针及实验所标记探针用DNA稀释缓冲,以1∶10的稀释倍数稀释5个梯度,分别取1μL点于尼龙膜上80℃烘干。再分别用缓冲液1和缓冲液3洗膜。尼龙膜浸入含1∶5000Dig抗体的缓冲液 3 中,室温孵育30min。以缓冲液1和缓冲液2分别洗膜15min。显色液中避光显色20min,终止液(TE)终止反应。将标记在膜上的显色强度与标准对照,即可测出标记探针的含量。

  1.6组织切片的原位杂交分别将40μm振荡切片用0.1mol/L 磷酸缓冲液漂洗,0.1mol/L甘氨酸/磷酸缓冲液漂洗5min,40g/L多聚甲醛固定5min,0.1mol/L磷酸缓冲液再次漂洗10min,2.5g/L乙酸酐/0.1mol/L三乙醇室温放置10min,切片移入反应板,加20μL/切片的杂交液,42℃杂交液过夜,移入漂洗槽中,分别以4、2、1、0.5倍柠檬酸钠缓冲液(SSC)漂洗,0.05mol/L磷酸缓冲液37℃漂洗,移入反应板,按50μL/切片加入1∶1000标记探针,2mol/L二硫苏糖醇室温过夜。移入漂洗槽,0.05mol/L 磷酸缓冲液充分漂洗,再以缓冲液1和2分别漂洗,移入反应板,显色剂4℃显色12h,移入漂洗槽,TE终止反应,漂洗、裱片、脱水、透明,中性树脂封片,显微镜观察、摄片。另设对照:单独使用Dig标记探针。

  1.7统计学方法在光镜下细胞浆呈紫色者为NMDAR1 mRNA阳性神经元。在图像分析仪上测定阳性染色细胞的染色光密度(D)值,每例随机计算每100mm2内的阳性细胞数。采用EXCEL97软件进行数据的统计。统计方法为完全随机设计的多样本均数比较的方差分析及两样本均数比较的t检验,检验水平α=0.05。

  2结果

  各组神经细胞NMDAR1 mRNA阳性细胞数和染色光密度值变化比较见表1、图1(见彩图页第666页)。与假手术组比较,模型组大脑皮质神经细胞NMDAR1 mRNA的阳性细胞数和D值均显著增高(P<0.01或P<0.001);与模型组比较,中药高、中剂量组阳性细胞数显著减少(P<0.01或P<0.001),中药高剂量组的D值显著降低(P<0.01),而中药中、低剂量组的D值和中药低剂量组阳性细胞数无显著改变(P>0.05)。说明通脉注射液高剂量组对神经细胞NMDAR1 mRNA表达的抑制作用最为显著。表 1各组神经细胞NMDAR1 mRNA阳性神经元数和染色光密度值比较(略)

  3讨论

  1969年Olney以外周注射大剂量谷氨酸钠导致了动物下丘脑弓状核神经元的损伤,首次提到了兴奋性神经毒性作用的理论[6],1971年进一步阐明了脑内兴奋氨基酸的兴奋毒性作用,并提出了兴奋性毒性学说的概念,这种在正常情况下作为兴奋性神经递质的氨基酸,在病理条件下产生神经毒性作用而导致神经元死亡的现象,称为兴奋性毒性作用[7]。该学说核心内容是指兴奋性氨基酸递质的过量释放对脑细胞产生兴奋性毒性,引起神经细胞水肿、空泡形成和细胞死亡[8]。谷氨酸作为中枢神经系统中分布和含量最高的兴奋性神经递质,它通常以囊泡形式贮存于突触末端,在生理或病理的刺激下可释放入突触间隙,主要通过其结合突触后膜上特异性受体NMDAR,启动一系列生化反应引起神经细胞死亡[3]。

  NMDAR是中枢神经系统中分布最广泛的受体之一,是由NMDAR1和NMDAR2两个亚单位共同构成的受体通道复合物[9]。NMDAR2伴随NMDAR1存在于特定脑区,它可以增强NMDAR1对兴奋性氨基酸的反应,但NMDAR2独立存在时并不表达受体活性,因此,NMDAR1被认为是NMDA受体的主要功能单位[10]。

  研究表明,NMDAR1 mRNA在大鼠的大脑皮层、海马和小脑中均有表达,其表达的空间方式和程度与放射自显影技术研究结果基本一致[11]。NMDAR1表达的区域特异性被认为是皮层、海马等选择性易损区的分子基础[12]。脑缺血后的病理过程出现NMDAR1的表达变化,亦进一步为NMDAR参与兴奋性神经毒性作用提供了依据。NMDAR1作为NMDAR的主要功能单位,一定程度反映出NMDAR的水平。

  NMDAR1 mRNA是NMDAR1的信使RNA,NMDAR1 mRNA表达的强弱反映了NMDAR1的转录水平,间接地反映出NMDAR1的表达。本研究结果表明,脑缺血再灌注后模型大鼠大脑皮层NMDAR1 mRNA表达的信号较假手术组明显增多,其作用的可能机制是脑缺血后突触囊泡大量释放谷氨酸入突触间隙中,作用于NMDAR1的谷氨酸结合位点,使神经细胞处于兴奋状态,其受体转录活性增大,对其表达起上调作用,最终使合成的受体蛋白增多,并与迅速释放的谷氨酸(Glu)相结合发挥兴奋性神经毒性作用。脑缺血再灌注后早期NMDAR1 mRNA的过度表达可能是引起NMDA数量增加、活性增高,导致兴奋性氨基酸神经毒性的重要因素之一[1]。
本实验观察了通脉注射液对脑缺血再灌注后大鼠大脑皮质神经细胞NMDAR1 mRNA表达的作用,结果显示通脉注射液高、中剂量组大鼠大脑皮质NMDAR1 mRNA杂交信号低于缺血模型组,而通脉注射液低剂量组NMDAR1 mRNA杂交信号与模型组比较差异无显著性意义。这一结果证实了中、高剂量通脉注射液可干预NMDAR1转录,影响到转录的水平。通脉注射液对NMDAR1表达的影响,可能与其能减少Glu的释放,直接抑制神经细胞的兴奋性,使细胞下调NMDAR的表达有关,确切机理尚需今后进一步研究的结果加以论证。

  前期研究表明,通脉注射液可以减少缺血后脑组织中谷氨酸的含量,降低缺血再灌注后皮质神经元的NMDAR活性[13],是从受体蛋白质水平来进行的研究。本研究又从NMDAR的基因表达角度观察到:通脉注射液可选择性地抑制NMDAR1的转录过程,减弱NMDAR1的表达,最终影响到NMDA受体的合成。综上所述,通脉注射液可能是使NMDA受体的数量减少或活性降低,减弱脑缺血再灌注导致的兴奋性氨基酸毒性过程,从而削弱了兴奋性神经毒性引发的神经细胞溃变和坏死,达到脑保护的治疗作用。

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  [13]朱兆洪,丁柱,刘茂才. 通脉注射液对脑缺血再灌注大鼠兴奋性毒性作用的干预机制[J].广州中医药大学学报,2003,20(3):227.

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