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罗布麻叶顶空气相色谱—质谱指纹图谱的研究

首席医学网      2010年11月23日 20:44:35 Tuesday  
 
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作者:相淞华,宋建平,刘训红,张月婵    作者单位:1.南京市药品检验所,江苏南京210015;2. 盐城卫生职业技术学院,江苏盐城224006;3. 南京中医药大学,江苏南京210046

【摘要】    【目的】建立罗布麻叶挥发性成分顶空气相色谱—质谱(HSGCMS)指纹图谱分析方法,评价不同产地罗布麻叶药材的质量。【方法】采用HSGCMS联用技术对不同产地罗布麻叶的挥发性成分进行分析,测定其指纹图谱,确定共有指纹峰,并作模糊聚类分析和相似度评价。【结果】罗布麻叶挥发性成分中含有14个特征性指标成分,初步建立了以此14个共有峰为特征指纹信息的HSGCMS指纹图谱。【结论】本方法准确可靠,重复性好,可作为罗布麻叶质量评价的依据。

【关键词】  罗布麻叶/化学;挥发性成分/分析;指纹图谱

  罗布麻叶为《中国药典》收载的常用中药,系夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetom L.的干燥叶,具有平肝安神、清热利水之功效[1]。现代用于治疗高血压、高血脂、冠心病、哮喘、气管炎等疾病有较好的效果[2]。罗布麻叶挥发性成分为主要活性成分之一,如芳樟醇有镇静、降血压、抗菌等作用[3],薄荷酮和胡薄荷酮有解热、镇痛、抗炎作用[4],藏红花醛有较强的抗癌活性[5],氧化石竹烯有平喘、镇静、抗癌作用,1α萜品醇有显著平喘功效[6],但尚未见有关罗布麻叶挥发油指纹图谱研究的报道。本研究采用顶空气相色谱—质谱(HSGCMS)联用技术对不同产地罗布麻叶的挥发性成分进行分析,现报道如下。

  1仪器与试药

  Agilent 6890/5975B型气—质联用分析仪,G1701DAD.03.00.611工作站,Agilent G1888顶空自动进样器(美国安捷伦仪器公司),NIST05标准质谱检索库。

  罗布麻叶各产地样品为实地采集或由当地药材公司提供,编号为:S1江西,S2安徽,S3吉林,S4山东,S5山西,S6江苏,S7新疆,S8河北,S9内蒙古,S10天津,S11辽宁,S12陕西。均经研究者鉴定为夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetom L.的叶。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。

  2方法与结果

  2.1分析条件

  2.1.1色谱条件色谱柱:HP5MS(涂布浓度为5%的苯甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱,30.0 m×250 μm×0.25 μm);进样口温度:180℃;程序升温:50℃保持20 min,以4℃/min的速率升至200℃,保持5 min;载气:He气,流量:1.0 mL/min,分流比15∶1。

  2.1.2质谱条件电离方式:电子轰击离子源(EI);离子源温度:230℃,四级杆温度:150℃,接口温度:280℃;电子倍增器电压:1 329.4 V;电子能量:70 eV;扫描范围:45.0~650.0 aum。

  2.2顶空供试品制备

  通过对药材粉碎粒度、体积装样量、顶空加热温度及顶空加热时间进行考察,确定罗布麻叶挥发性成分优化的顶空条件:取罗布麻叶粉末(过40目筛)3 g,精密称定,置顶空瓶中,密封,放入顶空进样器,120℃加热平衡30 min,供测试。

  2.3方法学考察

  2.3.12 h记录图取罗布麻叶挥发性成分进样分析,结果表明:60~120 min无出峰,提示50 min内挥发性成分出峰完全。

  2.3.2精密度试验取罗布麻叶(S2)挥发性成分进行分析,连续进样5次。结果表明:14个指标成分群保留时间的相对标准偏差均小于0.21%,相对含量的相对标准偏差均小于5%,提示仪器精密度良好。
  
  2.3.3稳定性试验取罗布麻叶(S2)挥发性成分进行分析,分别在1、3、6、24、48、120 h进样6次,得14个主要特征峰保留时间、相对含量。结果表明:14个指标成分群保留时间相对标准偏差均小于0.29%,相对含量的相对标准偏差均小于5%,提示120 h内样品(溶液)稳定性较好。

  2.3.4重复性试验取同一批次罗布麻叶(S2)5份,提取挥发性成分后分别进样分析,得14个主要特征峰的保留时间和相对含量。结果表明:14个指标成分群保留时间的相对标准偏差为0%~1.37%,相对含量的相对标准偏差为1.83%~5.15%,说明重复性较好。

  2.4指纹图谱建立

  样品按选定的顶空条件及分析条件进行分析,测得所有供试品的气相色谱—质谱(GCMS)总离子流图;再对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得质谱图,所有组分质谱数据经计算机处理和NIST05标准质谱图库检索鉴定,并与有关标准谱图核对,初步确定出罗布麻叶挥发性成分中53种化合物。根据罗布麻叶挥发性成分HSGCMS总离子流图所给出的峰数高、峰保留时间和峰面积值等相关参数以及成分鉴定结果,进行分析、比较,制定HSGCMS指纹图谱(图1,见彩图页第666页)。

  2.5指纹图谱分析

  2.5.1共有指纹峰的标定经对挥发性成分GCMS总离子流图的分析、比较,罗布麻叶标定14个共有峰作为指纹图谱的特征峰,1~14号峰化学成分依次为:2戊烯1醇、未鉴定、1,2,5,5四甲基1,3环戊二烯、3,5二甲基苯酚、安息香醛、2戊基呋喃、顺式氧化芳樟醇、2,6二甲基环己醇、薄荷酮、藏红花醛、β环柠檬醛、胡薄荷酮、大马酮、5,6,7,7A四氢4,4,7a三甲基(4H)苯呋喃酮。以2戊基呋喃(6号峰)为参照峰,分别求出各共有峰与之相比的α值(调整保留时间之比)和各共有峰的相对峰面积(峰面积之比),见表1。表1罗布麻叶挥发性成分中共有峰的相对保留时间α值和相对峰面积(略)

  2.5.2指纹图谱的聚类分析选择罗布麻叶挥发性成分中14个比较明显的共有峰,根据表1中的数据,采用SPSS 15.0软件中的hierarchical cluster analysis对12个罗布麻叶样品进行聚类分析,所用聚类方法为average linkage (between groups),距离公式为square euclidean distance,得不同样品罗布麻叶的聚类分析图。

  图2结果显示:当距离标尺在1时,样品5、6、11,样品1、3、10,样品2、9各归为一类;当距离标尺在2时,样品5、6、11与样品4、8归为一类;当距离标尺在3时,样品4、5、6、8、11与样品1、3、10归为一类,样品2、9与样品7归为另一类;当距离标尺在8时,样品1、3、4、5、6、8、10、11与样品2、7、9归为一类;当距离标尺在25时,样品12才与样品1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11即全部聚为一类。

  2.5.3色谱峰的重叠率以罗布麻叶9号样品图谱为基准,按以下公式计算重叠率=[待测样品与标准样品共有的峰数×2/(待测样品与标准样品峰数和)]×100%。分别求得另外11种样品色谱峰的重叠率依次为:64.0%、82.5%、72.7%、79.5%、78.9%、75.7%、76.3%、67.6%、64.7%、74.6%、92%。

  2.5.4相似度评价将测试数据导入Excel表格,采用中位数夹角余弦法计算相似度,进行色谱峰差异性评价和整体相似性评价。各相似度值如下:S10.959、S20.925、S30.977、S40.986、S50.991、S60.957、S70.979、S80.963、S90.973、S100.987、S110.932、S120.888。结果显示,罗布麻叶样品指纹图谱相似度较好,均在0.88以上。

  3讨论

  挥发性成分顶空条件的优化:药材粉碎粒度的考察结果表明,60目药材粉末所得色谱峰峰数比40目、30目药材峰数明显减少,40目所得色谱峰数峰高较30目高,故粉碎粒度选择40目药材粉末。体积装样量的考察测定结果表明,1.5 g药材所测出的色谱峰数较少,2 g药材峰面积较小,3 g药材测出的色谱峰较多,峰面积较大,故体积装样量选择3 g。

  顶空加热温度的考察测定结果表明,90℃和100℃加热温度下检出色谱峰的峰数明显减少,110℃和120℃加热检出的色谱峰中后者峰高较高,故样品加热温度选择120℃。顶空加热时间的考察测定结果表明,4个不同加热时间下的峰数相差不多,加热30 min的峰高较高,故样品加热平衡时间选择30 min。

  不同产地罗布麻叶中均含有2戊烯1醇、未鉴定、1,2,5,5四甲基1,3环戊二烯、3,5二甲基苯酚、安息香醛、2戊基呋喃、顺式氧化芳樟醇、2,6二甲基环己醇、薄荷酮、藏红花醛、β环柠檬醛、胡薄荷酮、大马酮、5,6,7,7A四氢4,4,7a三甲基(4H)苯呋喃酮等14种主要成分,占挥发性总成分的60%左右,故以此14个特征性指标成分作为共有特征峰构建GCMS指纹图谱。

  应用模糊聚类法分析比较,能揭示挥发性成分中特征性成分质量分数的配比关系,更能全面、综合、准确地反映不同产地药材GCMS指纹图谱的关系,本实验初步建立了罗布麻叶挥发性成分GCMS指纹图谱分析方法,而且方法准确可靠,重复性好,为罗布麻药材的质量评价和GAP实施提供了科学依据。

【参考文献】
    [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2005:147.

  [2]张振杰. 药用罗布麻(红麻)叶的化学成分研究[J].中草药通讯, 1974(1): 21.

  [3]姚雷.吐露芬芳却为谁[J]?生命世界,2007(12):64.

  [4]刘森,郝保华,李伟泽,等.水凝胶型荆芥油泡沫气雾剂的制备及性质研究[J].中草药,2008,39(2):218.

  [5]邓颖,郭志刚,曾兆麟,等. 藏红花的药理研究进展[J].中国中药杂志,2002,27(8):565.

  [6]范维刚,解成喜,李锋,等.罗布麻叶挥发油的气相色谱—质谱分析[J].质谱学报,2005,26(2):93.

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