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HPLC法测定独子藤中雷公藤红素的含量

首席医学网      2010年12月06日 16:13:51 Monday  
 
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作者:刘慧琼1,李国成2,卢绮雯1,王定勇1     作者单位:(1.广东药学院 药科学院,广东 广州510006; 2.中山大学附属第二医院 药剂科,广东 广州 510120)

【摘要】  目的建立高效液相色谱法测定独子藤中雷公藤红素的含量,为雷公藤红素的药用植物资源开发提供依据。方法 采用Supelco Discovery C18柱(25 cm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-5%(体积分数)H3PO4水溶液(体积比80∶20),流速为1.0 mL·min-1,检测波长为426 nm。结果 雷公藤红素在40~200 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 1)。独子藤中雷公藤红素的平均质量分数为0.055 5%,雷公藤红素的平均回收率为97.6%,RSD=1.78% (n=6)。结论 该方法简便、准确、灵敏度高、重现性好,可用于独子藤中雷公藤红素的含量测定;独子藤中雷公藤红素含量较高,可作为雷公藤红素的资源植物加以开发利用。

【关键词】  独子藤;雷公藤红素;高效液相色谱法;成分分析

 Abstract:ObjectiveTo determine the content of tripterine in Celastrus monospermus Roxb by HPLC for developing the medicinal resources of celastrol.Methods An external standard method by HPLC with Discovery C18 column (25 cm×4.6 mm,5 μm) was employed.The mobile phase was consisted of methanol-5%(φ) phosphoric acid solution (80︰20) (ξ)at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 426 nm.Results It showed good linearity in the range of 40-200 μg·mL-1 (r=0.999 1).The content of tripterine in Celastrus monospermus Roxb was 0.055 5%,and the average recovery rate of celastrol was 97.6%(RSD=1.78%,n=6).Conclusion The method is simple and accurate,sensitive and reproducible and can be used in the quality control of Celastrus monospermus Roxb.The content of tripterine in Celastrus monospermus Roxb was high,which can be exploided as the herbal resource.

  Key words:Celastrus monospermus Roxb; tripterine; HPLC; assay

  独子藤(Celastrus monospermus Roxb.)为卫矛科南蛇藤属植物,分布于我国福建、广东、云南、贵州、广西等省区及越南和印度等地,主要生长于海拔1 000 m以上的林带中[1]。研究表明独子藤的化学成分主要为生物碱和木栓烷型三萜类化合物,其中木栓烷型三萜类化学成分对风湿病、白血病和皮肤病均有较好疗效[2]。雷公藤红素为木栓烷型三萜类化合物,是雷公藤片、雷公藤多苷片等治疗类风湿病制剂的有效成分之一,主要来源于中药雷公藤的根皮,具有抗炎、免疫抑制及抗肿瘤等多种药理活性[3]。中美科学家于2006年联合发现雷公藤红素的抗癌新机制[4],引发了雷公藤红素抗癌活性研究的热潮。我们在独子藤的化学成分研究中发现该植物根中富含雷公藤红素,是一种潜在的雷公藤红素植物资源,具有重要开发价值。但至今尚未见有关独子藤中雷公藤红素含量测定的文献报道。本文建立了独子藤中雷公藤红素的含量测定方法,对合理开发独子藤植物资源、促进雷公藤红素的深入研究,均具有重要意义。

  1仪器与试药

  1.1仪器

  Shimadzu LC-10AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司),SPD-10AT型紫外-可见检测器(日本岛津公司),HW-2000色谱工作站;Millipore溶液过滤器;Millipore 0.45 μm滤膜;AY120电子分析天平(Shimadzu公司);RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

  1.2试药

  雷公藤红素对照品(自制,经HPLC法测定纯度≥98%);独子藤于2008年10月采自广东省阳春市,由广东药学院李书渊教授鉴定为独子藤Celastrus monospermus Roxb.;硅胶(柱层析硅胶,青岛海洋化工有限公司);甲醇为色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

  2方法与结果

  2.1色谱条件

  色谱柱:Supelco Discovery C18柱(25 cm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-体积分数5%H3PO4水溶液(体积比80∶20);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:426 nm;柱温:25 ℃;进样量:20 μL。色谱图见图1。

  2.2对照品贮备液的制备

  精密称取雷公藤红素对照品5.0 mg,置25 mL容量瓶中,加适量甲醇溶解并定容,摇匀,得到质量浓度为0.20 mg·mL-1的雷公藤红素对照品贮备液。

  2.3供试品溶液的制备

  取独子藤药材适量,粉碎过40目筛,精密称取10.0 g,装入100 mL带塞三角瓶中,加入三氯甲烷超声提取3次,每次50 mL,每次30 min。静置,滤取上清液,旋转蒸发仪上浓缩至干。称取4.0 g硅胶装柱(1.5 cm×10 cm),以三氯甲烷1 mL超声溶解样品,上样。先以三氯甲烷50 mL进行洗脱,弃去洗脱液,再用三氯甲烷-甲醇(体积比95∶5)100 mL洗脱,收集洗脱液,回收溶剂,旋转蒸发仪上浓缩至干。残渣用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中,045 μm微孔滤膜滤过。平行操作5份,作为1~5号供试品溶液。[PSd041;S*2〗A.对照品; B.供试品图1雷公藤红素的HPLC色谱图Figure 1HPLC chromatograms of reference

  2.4线性关系的考察

  分别精密吸取“2.2”项下对照品贮备液1、2、3、4、5 mL置于5 mL容量瓶中,分别用甲醇溶解并定容,摇匀,制得系列对照品溶液。依次取上述溶液各20 μL进样,依法测定。以雷公藤红素的峰面积积分值(A)为纵坐标,质量浓度(ρ)为横坐标绘制标准曲线,得回归方程为A=5.5886×103ρ-2.0127×104(r=0.999 1)。结果表明,雷公藤红素在40~200 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

  2.5精密度试验

  精密吸取同一雷公藤红素对照品溶液20 μL,连续进样6次,测得雷公藤红素的峰面积RSD为196%,结果表明仪器精密度良好。

  2.6稳定性试验

  取同一供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、12 h进样,依法测定,结果雷公藤红素峰面积的RSD为298%,表明供试品溶液在12 h内稳定。

  2.7重复性试验

  取同一批次的独子藤药材,称取5份,按“2.3”项下方法处理并进样测定,结果雷公藤红素峰面积的RSD为2.59%,表明本方法重复性良好。

  2.8加样回收率试验

  取独子藤药材6份,各5 g,精密称定,分别按低、中、高不同质量精密加入雷公藤红素对照品,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,依法测定,计算回收率,结果见表1。表1加样回收率试验

  2.9样品测定

  分别精密吸取“2.3”项下1~5号供试品溶液20 μL,注入色谱仪,依法测定。每份测3次,计算,结果其雷公藤红素的质量分数分别为0.054 7%、0056 2%、0.055 3%、0.054 0%、0.057 2%,平均值为0.055 5%,RSD为2.26%。

  3讨论

  3.1本研究对不同样品前处理方法效果进行了考察,比较了三氯甲烷超声提取后直接进样与三氯甲烷超声提取后经硅胶柱层析纯化再进样的色谱图。结果显示,前者杂质峰数目较多,对色谱柱的污染较大;而后者能有效去除其他极性杂质,雷公藤红素色谱峰与其他峰分离良好,测定无干扰。

  3.2本研究在参照文献[5-7]的基础上,考察了不同流动相的分离效果。结果表明流动相为甲醇-体积分数5%H3PO4水溶液(体积比80∶20)时,雷公藤红素的峰形对称且能与其他成分良好分离,同时亦有利于独子藤中其他成分的含量测定。

  3.3本文方法测得独子藤中雷公藤红素的平均质量分数为0.055 5%,相对较高,提示可将独子藤作为雷公藤红素的药用植物资源加以开发利用,具有重要意义。且雷公藤红素的毒性很大,建立并完善雷公藤红素的含量测定方法,亦有助于安全合理地利用独子藤药材。

【参考文献】
   [1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴:第二册[M].北京:科学出版社,1980:661.

  [2] 刘锡葵,吴大刚.独籽藤中木栓烷三萜化学成分[J].中草药,1993,24(8):395-397.

  [3] 夏玲红,崔岚.雷公藤红素的药理作用研究进展[J].医药导报,2009,26(6):730-732.

  [4] YANG Huan-jie,CHEN Di,Cui Qiu-zhi, et al.Celastrol,a triterpene extracted from the Chinese “Thunder of God Vine,” is a potent proteasome inhibitor and suppresses hhuman prostate cancer growth in nude mice[J].Cancer Res,2006,66(9):4758-4765.

  [5] 冯玉静,王定勇,陈铭祥.南蛇藤中扁蒴藤素提取分离工艺研究[J].广东药学院学报,2009,25(2):137-140.

  [6] 库尔班江,赛德艾合买提,张焱.雷公藤制剂中雷公藤红素的高效液相色谱法测定[J].新疆师范大学学报:自然科学版,2008,27(4):42-45.

  [7] 库尔班江,张焱.雷公藤药材中雷公藤红素的高效液相色谱法测定[J].西北药学杂志,2008,23(2):82-84.

  (责任编辑:刘晓涵)

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